本发明专利技术提供了一种尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，以及该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。本发明专利技术的单克隆抗体对NNMT蛋白均具有较高的抗体效价，亲和力和纯化后较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用于对NNMT蛋白的科研研究领域，也可应用于临床检测，对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况，有助于NNMT相关肿瘤的诊断、治疗和预后判断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2. I. I. I)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体，以及单克隆抗体在制备检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的试剂盒中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤严重危害人类健康，据世界卫生组织最新数据显示，到2020年前，每年将新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅速上升，2007年全球共有760万人死于癌症，2030年这个数字可能会增至1320万。肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡率或提高治疗的效果，许多研究致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤早期诊断、分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志物一直是肿瘤学的研究热点。尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2. I. I. I)正是今年用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现的癌组织中异常表达的蛋白质酶。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌和胰腺等肿瘤组织有过表达，并在多种肿瘤患者的血清中升高。这些研究提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响华、放疗效果。NNMT正常表达于人肝脏组织中，其他组织如肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活性差异较大，活性的高低取决于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关，与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后调控异常所致，可能受肝细胞核因子-I (HNF-I) ,TGF-^ I、STAT3等激活。NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)为供体，催化尼克酰胺和吡啶类物质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生物转化，是催化药物、异型生物质代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼克酰胺参与细胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产NAD，而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗，细胞的寿命等。帕金森综合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通过两条途径导致帕金森综合症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激活导致线粒体复合体I受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼克酰胺还能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、坏死、凋亡等多细胞调节来保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT在肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步明确NNMT作为在肿瘤防治中的价值。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种能稳定高效分泌抗NNMT蛋白的抗体的杂交瘤细胞株，以及该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。本专利技术采用的技术方案是一种尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株1E7，保藏于中国典型 培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮政编码430072，保藏日期2011年8月31日，保藏编号CCTCC N0C 201167。该细胞株由尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠后，筛选获得。本专利技术还涉及一种由所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体(1E7)。经检测，所述单克隆抗体为IgG亚类、2a K轻链型。本专利技术还涉及所述的单克隆抗体在制备检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的试剂盒中的应用。由于本专利技术的单克隆抗体对于NNMT蛋白均有高水平的抗体效价，因此本专利技术的单克隆抗体或其活性片段或其保守性变异体，或其任意组合可用于制备用于检测NNMT蛋白的试剂、药剂或试剂盒。所述试剂、药剂或试剂盒可用于检测NNMT蛋白，从而可以进一步用于诊断、治疗和预后判断NNMT相关肿瘤。本专利技术的试剂、药剂或试剂盒优选包括标记的本专利技术的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。所述标记指生物标记或化学标记，例如酶标记的或突光标记的(例如荧光素标记)或化学发光标记的。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白时具体可采用双抗夹心法进行检查NNMT蛋白抗原，具体为先将一抗(特异性单克隆抗体)与相应的(临床样本中的)组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标记的抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。本申请专利技术人采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能稳定分泌抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接ELISA法筛选并进行，获得了能分泌的细胞系及由所属细胞系产生的单克隆抗体。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术的1E7单克隆抗体对NNMT蛋白均具有较高的抗体效价，亲和力和纯化后较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用于对NNMT蛋白的科研研究领域，也可应用于临床检测，对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况，有助于NNMT相关肿瘤的诊断、治疗和预后判断。附图说明图I为2F8、1E7腹水及纯品抗体SDS-PAGE电泳图；M =Marker I 2F8腹水2 2F8纯品抗体3 1E7腹水4 1E7纯品抗体；图2为2F8细胞株分泌抗体的亚类、轻链型鉴定结果；图3为1E7细胞株分泌抗体的亚类、轻链型鉴定结果； 图4为2F8纯品抗体凝胶扫描图；图5为1E7纯品抗体凝胶扫描图； 图6为2F8、1E7细胞株纯品抗体的亲和力反应曲线图；图7为2F8细胞株单抗的免疫印迹；M =Marker I =NNMT-GST融合蛋白2:NNMT蛋白 3:GST蛋白；图8为1E7细胞株单抗的免疫印迹;M =Marker I =NNMT-GST融合蛋白2:NNMT蛋白 3:GST蛋白；图9为肝脏正常组织的免疫组化(X 100)；图10为透明细胞型肾癌(a)及正常肾组织(b)的免疫组化(X100)；图11为乳头状甲状腺癌(a)及正常甲状腺组织(b)的免疫组化(X 100)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例I :杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选及制备I、单克隆抗体的制备I. I、免疫原的制备免疫原为GST-NNMT融合蛋白及NNMT蛋白，利用基因工程技术制备NNMT蛋白构建pGEX-4T-2/NNMT质粒，转化到大肠杆菌BL_21-STAR (DE3)中以表达GST-NNMT融合蛋白。然后将融合蛋白纯化后，通过加入凝血酶使其融合蛋白充分酶切，再次纯化后获得NNMT蛋白(geneBank 登录号ACA06031. I)。I. 2、动物免疫免疫程序为初次免疫取6 8周龄BALB/C雌性小鼠，将NNMT蛋白与弗氏完全佐本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张钧，谢鑫友，杨肃文，王燕忠，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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