本发明专利技术阐述了一种光滑球拟酵母基因组规模代谢网络模型构建的方法及应用技术，属于系统生物学领域。该模型的构建方法是一种全面的半自动构建方法：基于自动化的模型，结合光滑球拟酵母蛋白质同源性的比较基因组学注释和菌体特异性信息。本发明专利技术提出了一种营养缺陷型特性在光滑球拟酵母代谢网络的表征方法：通过添加菌体缺失的必须营养物质到生物量方程中。在光滑球拟酵母代谢网络模型中单基因敲除乙醇脱氢酶，运用流量平衡分析，使得丙酮酸产量增加。本发明专利技术为全面理解和改造光滑球拟酵母的生理生化代谢提供了一个高效的平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种营养缺陷型酵母光滑球拟酵母(Candida glabrata)的全基因组规模代谢网络(Genome Scale Metabolic Model,GSMM)的构建方法以及通过模型模拟分析而得到菌体改造的策略，属于系统生物学领域。
技术介绍
工业系统生物学包括搜集、分析、整合基因组规模的高通量组学数据，从而获得目标生物系统的量化表型描述。不断更新的系统生物学工具箱被广泛用于基于基因组规模的代谢网络模拟，从而指导工业微生物代谢中间物的生产。典型实例有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)利用木糖产酒精，大肠杆菌(Escherichia coli)生产 I,3_丙二醇的代谢物流量分析(Metabolic Flux Analysis, MFA),曼玻拍酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)在基因敲除改造下生产琥拍酸。光滑球拟酵母是一种多重维生素缺陷型的酵母，能够在胞外积累丙酮酸。关于丙酮酸生物合成的研究主要涉及营养条件的优化，菌种选育，辅因子工程调控，耐酸性和高渗胁迫等，但是丙酮酸产量提高的瓶颈依然存在。基因组规模的代谢网络模型，是从全局的角度解析菌体生理生化代谢，从而解决丙酮酸高效生产的科学问题。随着各类资源(基因组数据库、生化反应数据库、酶学数据库、蛋白定位数据库、特异性物种信息数据库、基于约束条件的模型构建与分析软件等)的公开与发展，基因组规模代谢模型的数量呈指数增长。由于特异性生物体拥有的资源不同和模型构建方法的差异，导致模型质量参差不齐。自动化模型构建方法会因为不完全的基因注释而产生网络漏洞，需要被修正为一个有实际功能的符合基因-蛋白-反应(Gene-Protein-ReactiomGPR)关系的模型。然后通过假稳态(Pseudo steady-state)下的流量平衡分析(Flux BalanceAnalysis,FBA)得到不同限制性约束条件下的代谢流量分布解空间(Solution space)。通过基因组规模代谢网络模型的模拟分析，可以验证、预测生物体的生长表型和代谢途径，为代谢工程改造中关键因子的发现提供系统生物学依据等。
技术实现思路
本专利技术提供了一种营养缺陷型酵母光滑球拟酵母基因组规模代谢网络模型构建的方法，并且通过该模型模拟解析出提高丙酮酸产量的技术。—种半自动的构建光滑球拟酵母基因组规模代谢模型的方法1.利用一种自动化方法构建模型框架。2.比较基因组学注释光滑球拟酵母与比较菌株(模式菌株和近亲菌株)氨基酸序列同源性分析注释其生理生化代谢功能，光滑球拟酵母和转运数据库TCDB里所有蛋白序列同源性比较，注释其转运功能。3.结合与光滑球拟酵母代谢功能相关的文献组学信息。4、用 COBRA (constraint-based reconstruction and analysis)工具箱验证分析模型的实用性，具体如图I。 光滑球拟酵母的基因组规模代谢网络模型概况六个亚细胞器分区分别是细胞质、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、液泡及胞外空间；804个基因占基因总数的15.4% ；1023个代谢物中632个是不依赖分区的独立代谢物；1278个反应中三个与光滑球拟酵母的生物量组分直接相关，包括自由脂肪酸组成，细胞壁成分和生物量方程。在生物量成分中，硫胺素、烟酸、生物素和吡哆醇生物合成途径缺陷，须从培养基中摄取以维持细胞模拟生长。此专利技术可用作在基因组规模代谢网络模型中，营养缺陷型生物体代谢功能缺失的表征。在光滑球拟酵母全基因组代谢网络模型中，用代谢流平衡分析模拟敲除乙醇脱氢酶前后反应流量的变化，发现敲除前流向副产物乙醇的碳流全部转向丙酮酸，使得丙酮酸胞外积累量增多。此专利技术可以作为提高光滑球拟酵母丙酮酸产量的代谢工程改造的技术。附图说明图1 一种半自动法构建光滑球拟酵母基因组规模代谢网络模型工作流程图2模拟敲除乙醇脱氢酶前后对细胞生长和产物生成的影响具体实施例方式实施例I利用KEGG converter搭建模型框架。在KEGG数据库中下载光滑球拟酵母代谢途径的KGML格式文件，用KEGGconverter软件将所有代谢途径融合形成系统生物学标记语言(Systems Biology MarkupLanguage, SBML)格式的代谢网络模型。实施例2根据蛋白序列同源性对光滑球拟酵母基因组序列注释比较菌株在已被构建基因组规模代谢网络模型的微生物中选择。首先从系统发生树出发，选择亲缘关系近的属同一科的微生物。这里选择酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母作为光滑球拟酵母的近亲微生物。为保证基因注释的全面性，模式微生物如黑曲霉、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌也被作为比较菌株。从UniprotKB中下载上述微生物的蛋白序列的FASTA格式，分别与光滑球拟酵母的蛋白序列作BLASTp。比对结果满足相似度大于35%且E值小于10_3°，同时相似的长度与任一序列长度的比值大于70%，被认为有相同代谢功能的同源序列(选择示例见表I)。基于蛋白序列同源性的注释，可以补充KEGG对光滑球拟酵母代谢途径的注释。例如光滑球拟酵母的丙酮醛降解途径和高级醇代谢等。表1C. glabrata和P. pastoris蛋白序列同源性比对结果权利要求1.一种光滑球拟酵母基因组规模代谢网络的构建方法，其特征在于从一个运用自动化方法构建的光滑球拟酵母基因组代谢初模型出发，通过基于蛋白序列同源性的比较基因组学注释和菌体特异性生理生化信息补充，得到一个符合基因蛋白反应关系的可以运用COBRA工具箱分析的矩阵模型。2.根据权利要求I所述，光滑球拟酵母基因组模型构建步骤 .1)自动化构建用KEGGconverter软件处理从KEGG网站上下载的、与光滑球拟酵母代谢相关的KGML格式文件，得到光滑球拟酵母的自动化代谢网络模型； .2)比较基因组学注释比较光滑球拟酵母与模式微生物、近亲缘微生物的蛋白序列，以及比较光滑球拟酵母与转运数据库T⑶B里所有蛋白序列； .3)目标菌体特异性代谢信息以(Candidaglabrata or Torulopsis glabrata)and (metabolism or physiology)为关键词在 Pubmed 和 Web of Science 中搜索与光滑球拟酵母生理代谢功能相关的文献信息。3.根据权利要求2中步骤2)中所选取的比较微生物的基因组代谢网络模型必须已被构建；其中模式微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母；近亲缘微生物是根据系统发生树选择与光滑球拟酵母同一科的微生物，这里为酿酒酵母和巴斯德酵母。4.根据权利要求2和3所述蛋白功能相似性用Blastp软件比对获得，筛选标准为相似度大于35%且E值小于10-30，同时相似的长度与任一序列长度的比值大于70%。5.权利要求1、2和4中所述的光滑球拟酵母是营养缺陷型微生物，缺失维生素BI、批哆醇、生物素、烟酸四种维生素的合成途径。6.根据权利要求5中所述营养缺陷型，这一特性在基因组规模代谢网络模型中的表征方法，是将微生物不能合成的营养物质添加到生物量方程中。7.根据权利要求5和6所述，将维生素BI、吡哆醇、生物素、烟酸添加到光滑球拟酵母基因组代谢模型的生物量方程中。8.一种基于光滑球拟酵母基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，徐楠，刘婷，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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