本发明专利技术公开了一种治疗鼻咽癌药物递送系统及其构建和应用方法。本发明专利技术采用生物相容性良好的的羟基磷灰石为载体，将能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMP1的脱氧核酶包装在HA颗粒上，再将脱氧核酶/HA复合物与细胞穿透肽相结合，构建出能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMP1的药物递送系统。该药物递送系统能介导脱氧核酶，对基因治疗鼻咽癌起到关键作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种基因治疗鼻咽癌药物递送系统的构建及应用。
技术介绍
鼻咽癌(na sopharyngeal carcinoma,NPC)是一种具有种族和地理分布差异的上皮细胞性恶性肿瘤，在中国南方人群中发病率比白种人群高100倍以上，为25-30/10万。该肿瘤是一个与遗传易感性、EBV感染相关的多基因疾病。流行病学研究显示EBV感染十分广泛，成年人的感染率可达98%;在大多数情况下，EBV感染宿主后以潜伏感染状态存在，在鼻咽癌中主要表达EBNA1、LMPU LMP2等病毒蛋白和非编码RNA(EBV-encoded RNA, EBER)。 研究证实LMPl (Latent membrane protein I)主要介导NF- k B、AP_1和STAT三条信号传导通路及信号传导通路之间的cross-talk，导致细胞周期紊乱、凋亡阻滞、细胞增殖失控， 是EBV编码的目前已被确证的具有瘤基因功能的致瘤蛋白，在EBV相关肿瘤的发病中起着重要作用。脱氧核酶(deoxyribozyme/DNAzyme)是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的短片段单链DNA，具有高效的催化活性和结构识别能力。脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合，能够特异性结合和切割靶基因mRNA，从而调控目标蛋白质的表达。具有极大的治疗、靶标验证、诊断潜力。我们研究团队以EBV阳性的细胞系及其裸鼠移植瘤为研究模型，以LMPl为研究靶标，建立了应用脱氧核酶从mRNA水平关闭致病基因的技术平台。在细胞和动物水平筛选出有活性的脱氧核酶；并首次将脱氧核酶与放疗联合应用，证实了靶向LMPl的脱氧核酶能够增强鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。目前基因治疗临床试验中采用的载体大多数为病毒载体，但因病毒载体存在安全性、伦理学以及免疫原性等诸多问题，非病毒载体(如脂质体、高分子聚合物等)的转染效果不理想。本专利技术采用生物相容性良好的羟基磷灰石为载体，将能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMPl的脱氧核酶包装在HA颗粒上，再将脱氧核酶/HA复合物与细胞穿透肽相结合，构建出能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMPl的药物递送系统。实验表明该药物递送系统能转染脱氧核酶，介导基因转染的效率均优于其他药物递送系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种能够靶向LMPl的药物递送系统，并将该药物递送系统应用于制备基因治疗鼻咽癌的制剂。一种治疗鼻咽癌药物递送系统，其特征在于，所述的药物递送系统由靶向LMPl的脱氧核酶(DZl)、羟基磷灰石(HA)和细胞穿透肽(CPPs)组成；其中靶向LMPl的脱氧核酶和羟基磷灰石形成复合体，然后与细胞穿透肽结合形成能靶向LMPl的药物递送系统。上述药物递送系统中DZl吸附、包裹在HA表面形成复合体，或者DZl填充在纳米 HA空心球或介孔HA颗粒的孔隙里形成复合体，然后在HA/DZ1复合体表面枝结或包裹细胞穿透肽。 所述的靶向LMPl的脱氧核酶序列为Sequence (5，to3，) gCA AAg gAA ggC TAg CTA CAA CgA AgA ggA Ckk。所述的羟基磷灰石为杆状、球状(包括实心球、空心球或介孔纳米球)、片状或蜂窝状。所述的轻基磷灰石粒径为5nm_1000nm。所述的羟基磷灰石可以在使用前采用聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇或精氨酸修饰。所述的细胞穿透肽含量为0-5 u g/lmg羟基磷灰石。所述的细胞穿透肽的序列为以下任一种PEP-I KETffffETffffTEffSQPKKKRKVHIV-Iprotein Tat(48-60) GRKKRRQRRRPPQQPenetrat in =RQIKIffFQNRRMKffKKplsl =RVIRVffFQNKRCKDKKTransportan=GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILP-b e t a =GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKVP-al pha :GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRRV。所述的药物递送系统的构建方法将靶向LMPl的脱氧核酶加入高压灭菌后的HA 溶液，摇匀、孵育，得到靶向LMPl的脱氧核酶和羟基磷灰石复合物；将靶向LMPl的脱氧核酶和羟基磷灰石复合物洗脱后加入细胞穿透肽，室温下放置至少20min后即可。所述的药物递送系统用于制备基因治疗鼻咽癌的制剂。本专利技术所构建的药物递送系统是以生物相容性良好的HA为载体的、能够靶向 LMPl的药物递送系统，其避免了病毒性载体系统存在的安全性、伦理学以及免疫原性等诸多问题，也避免了其他载体系统存在的代谢问题，其不仅能在体外转染，而且能够体内转染靶向LMPl的脱氧核酶，转染效率高，可用于鼻咽癌的基因治疗。附图说明图I :本专利技术的纳米HA透射电镜图；图2 :靶向LMPl的脱氧核酶DZl质谱图；图3 :本专利技术的药物递送系统的转染图。具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例I主要包括HA/DZI/CPPs药物递送系统构建(HA混悬液制备、纳米羟基磷灰石颗粒与脱氧核酶的结合实验、脱氧核酶/HA复合物与细胞穿透肽的结合)和基因转染实验组成。HA/DZI/CPPs药物递送系统构建 I、HA纳米粒混悬液制备将制备的HA纳米粒分成3组，一组为空白HA颗粒，一组为PEI修饰，一组为精氨酸修饰。HA纳米粒用去离子水配成25mg/ml溶液。用超声波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710, USA)，静置2h。HA纳米粒混悬液无分层，呈乳状。将混悬液置入50ml 玻璃瓶，高压灭菌后保存。2、纳米羟基磷灰石颗粒与脱氧核酶、细胞穿透肽的结合实验HA/DZI 复合物 A 液 80 U I HA(25mg/ml)+170U I RPMI1640(RPMI 是 Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维公园纪念研究所。RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基， 1640是培养基代号。B 液 8 ii I DZl (浓度为 5 u g/ml-60 u g/ml) +242 u I RPMI 1640将B液加入A液中，用灭菌的移液枪吹打2min，在摇匀机上孵育(500rpm，室温， Ih)得到HA/DZ1复合物溶液。将HA/DZI复合物洗脱(采用D-hanks液对HA/DZI复合物进行流洗使样品中其他组分分离而流洗出来)后分别加入O、Iii l、5ii I细胞穿透肽(浓度为g/ml-60 u g/ml)， 室温下放置20min得到HA/DZI/CPPs药物递送系统。基因转染实验I)细胞培养以2X105/ml、2. 5X105/ml 和 3X105/ml 的 CM 细胞CM 细胞是 CNEl 细胞(人鼻咽癌细胞)稳转LMPl建的细胞系密度接种到两块6孔培养板上，用无三抗小牛培养基培养，24小时后用做细胞转染实验。2)基因转染将6孔板中的细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞两遍，将本专利技术制备的HA/DZI/ CPPs药物递送系统逐滴加入孔中(本专利技术制备的HA/DZI/CPPs药物递送系统的加入量l-5ii g)，每孔再加入I. 5ml 1640培养基，摇动培养板，轻轻混匀。放入饭盒中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄苏萍，周科朝，孙仑泉，陈燕，杨力芳，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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