本发明专利技术是一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，该方法从-70℃的冰箱已保存的竹叶青蛇毒腺进行总RNA的提取，反转录成cDNA，根据Genebank中公布的序列(AY277739)利用引物设计软件进行设计引物，以cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增出竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因，并进行克隆和测序；试验表明本发明专利技术的重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别且重组蛋白低、中、高剂量组荷瘤小鼠生命延长率与阴性对照组均存在差异极显著。本发明专利技术为深入开发利用竹叶青蛇毒提供了依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础，具有广阔的生产和临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，属于生物医学
技术介绍
长期以来，一直被认为是“不治之症”的肿瘤是医药界研究热门课题之一。现有的抗肿瘤药物疗效很有限，而且大多有严重的副作用，使用效果远远没有达到人们的预期。目前市场上还有一类免疫治疗药物，即经过激活人的免疫功能以达到促进攻击癌细胞的药物也不少，但因各种癌细胞本身具有免疫力，所以疗效并不理想。因此，目前抗肿瘤药物的开发也成为本世纪新药研究的重大课题。蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种有潜力的抗肿瘤制剂，具有广阔的临床应用前景，但目前采用提取蛇毒L-氨基酸氧化酶的工业化生产还不现实。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，为研制新型的抗肿瘤药物打下基础并使得大规模制备蛇毒L-氨基酸氧化酶成为可能。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下的技术方案一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法。该方法按照下列步骤进行(I)竹叶青蛇毒毒腺总RNA的提取和RT从_70°C冰箱取出竹叶青蛇的毒腺，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取竹叶青总RNA ；以抽提的总RNA为模板反转录为cDNA，反应按照Promega公司逆转录试剂盒手册进行，其反应体系为42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR扩增以cDNA为模板，根据Genebank中公布的竹叶青L-氨基酸氧化酶的基因序列的开放阅读框利用Primer Primer 5. O软件设计引物进行PCR扩增；所述引物中，上游引物为含 BamHI 酶切位点 5’ -CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 ';含 HindIII 酶切位点 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3) PCR扩增产物的回收将PCR扩增产物于O. 8 %琼脂糖凝胶中进行电泳分离30min后，在紫外灯下观察并切下含有目的条带的凝胶，按照胶回收试剂盒说明回收DNA片段，回收产物保存于_20°C ；(4)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆与测序将扩增竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，并将其铺于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基平板中进行培养，在37°C培养12 16h后观察结果；挑取菌落进行接种在含50 μ g/mL氨苄青霉素(AMP)的LB培养液中，取2μ L为模板进行PCR鉴定，阳性的克隆菌株进行测序；(5)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件预测竹叶青蛇毒 L-氨基酸氧化酶基因开放阅读框，并用BLAST验证；用信号肽预测软件Signal IP进行信号肽预测，并通过BLAST搜索与竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因阅读框编码的氨基酸序列同源性高的其他同系物,并作比较。上述的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法，步骤⑵中，PCR反应体系为 2 X TaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA 产物3μ L ;无菌水19 μ L，上下游引物各 I. 5μ L ;反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸45s，循环扩增30次，最后 72°C延伸 IOmin0竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用。为验证竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的治疗效果，专利技术人进行了一系列的实验，其结果如下I.试剂与材料I. I试剂IPTG，Sigma公司产品;Taq酶，捷瑞生物公司产品；BamH I和Hind III， MBI 公司产品；SDS,TaKaRa 公司产品；DNA Marker DL2000,TaqPCR MasterMix,BL21 (DE3), 大连宝生物公司产品；DNA回收试剂盒，QIAGEN公司产品产品；PCR引物，由上海生工合成； pMD18-T-ALAg,由贵阳中医学院微生物实验室制备；Pet28a(+), Invitrogen产品。I. 2材料竹叶青蛇毒，采自贵州省思南县；白兔，购自贵阳医学院实验动物中心； 癌细胞株，购于中科院细胞所。2 方法2. I兔抗竹叶青蛇毒LAAO阳性血清的制备竹叶青蛇毒用甲醛脱毒后，按《海峡药学》，2009，21 (12) :217_220 (张明芳、齐元麟)“眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、性质鉴定及细胞毒性测定”方法进行纯化竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶，加油佐剂(浓度为O. 2g/L)，免疫分为基础免疫和超免疫，在兔子的背部两侧肌肉注射(O. Iyg)进行基础免疫，每次间隔3周，在皮下和肌肉、穴位交替进行加强免疫，每只兔子lmg，每次免疫间隔2周。免疫后采用琼脂扩散试验测免疫血清效价，达到 28时进行采血分离血清。2. 2质粒DNA的小量提取从冰箱取出含pMD18-T-LAA0的DH5 α的EP管于冰浴溶解，1000r/min离心5min， 加入IOyL的LB液体培养基，37 °C 200rpm振荡培养lh，涂布于含有氨苄青霉素(Amp， 100 μ g/mL)的LB琼脂平扳上，37°C培养12 16h，挑取菌落进行加入100 μ L的LB液体培养基培养，离心取沉淀进行质粒DNA提取。2. 3Pet28a (+) -LAAO 构建和酶切鉴定pMD18-T-LAA0和Pet28a(+)质粒经BamH I和Hind III分别进行双酶切，回收目的片段进行连接并转化DH5 α，并将其铺于含有Amp的LB培养基平板中，挑取单个菌落加入 LB液体培养基中在37°C培养过夜，PCR检测为阳性菌落进行抽提质粒DNA。采用BamH I和 Hind III进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的菌株送往大连宝生物公司测序。2. 4重组蛋白诱导表达及SDS-PAGE将测序正确的菌株抽提Pet28a(+)_LAA0质粒转化BL21(DE3)，加入100 μ L的LB液体培养基，370C 200rpm培养lh，涂布于含有Amp的LB琼脂平扳上37°C培养12 16h，挑取单个菌落进行PCR，PCR阳性菌株加入5mL培养物经IPTG诱导表达3h，同时设未经IPTG诱导表达菌株作为对照。取诱导和未诱导的细菌培养物离心后，分别取沉淀和上清液按I : I 的比例加入2x上样缓冲液于煮沸5min，瞬间离心。在样品孔内分别加入待检样品(10 μ L/ 孔)进行电泳，同时设标准蛋白Marker，采用考马斯亮蓝R-250进行染色。2. 5重组蛋白的纯化按I : 100比例将培养过夜的BL21 (DE3)接种到新的LB液体培养基中，37°C培养至OD55tl= 1.0。在IPTG诱导表达3h进行大量表达，收集诱导表达菌。用I % PBS (pH 7.2) 洗涤菌体2次，然后用菌体裂解液重悬菌体并经超声破碎来裂解菌体，最后收集沉淀在4°C 温度下lOOOOgxlOmin离心，并通过去污剂的充分洗涤得到包涵体。将包涵体溶解于7mol/ L尿素中，经梯度透析复性法复性，即获得初步纯化的复性液，过滤除菌后备用。2. 7ffestern-blot将本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何光志，田维毅，王安宇，许滔，王平，曹锋，黄高，王文佳，
申请(专利权)人：贵阳中医学院，
类型：发明
国别省市：
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