本发明专利技术公开了一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，是利用pcDNA3.1(+)构建Smac/DIABLO基因突变型载体质粒pcSIG；然后将pcSIG质粒线性化，通过显微注射注入合子的原核中，培养，再移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；用Real-time?PCR验证得到的转基因小鼠F1代是否有突变基因的表达，最终获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型。本发明专利技术方法获得的Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠模型可以作为耳聋治疗药物的筛选平台，并利用所述模型分析，能够揭示致病基因突变导致耳聋的分子机制，为下一步预防和治疗提供有力支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因动物模型的制备方法，尤其涉及。
技术介绍
耳聋是导致言语交流障碍的常见致残疾病。耳聋不但严重阻碍儿童的言语、认知发育和学习发展，也给成年和老年人的工作、生活、人际交往带来严重影响，已成为世界性的公共卫生问题。它不但影响个人及家庭，而且给全社会带来沉重的负担。据WHO 2005年估计全球听力残疾人达2. 78亿，占世界总人口 4. 6% ;80%的听力残疾人生活在中、低收入国家。2006年我国第二次残疾人抽样调查结果显示各类残疾人的总数为8296万，其中听力言语残疾者达2780万，占残疾人总数的33. 52%。在新生儿中耳聋的发病率约为1/1000， 其中一半以上是由于遗传因素造成的，以常染色体隐性遗传为多见。耳聋的发病率随年龄的增长而增长，据估计45岁以下大约有5%，而80岁以上有大约50%的人群患有听力障碍，究其病因， 仍是遗传因素占主导地位。在目前的耳聋患者中有约占 50%的患者为遗传性耳聋，而遗传性耳聋中又有超过50%是由单一基因的突变造成的。遗传性耳聋分为综合征型(Syndrome deafness)和非综合征型(Non-syndrome deafness)两类(http://hereditaryhearingloss.org)。综合征型耳聋伴有其它症状，70%的遗传听力减退不伴有其它症状，故称为非综合征型耳聋。非综合征型耳聋的遗传模式有常染色体显性(autosomal-dominant, DFNA)、常染色体隐性(autosomal-recesive, DFNB)、X 连锁，Y 连锁及线粒体遗传5种。目前已有54个常染色体显性位点(DFNA)、71个隐性位点(DFNB)、5 个X连锁以及I个Y连锁位点被发现。在这54个常染色体显性耳聋(DFNA)位点中，成功克隆的耳聋基因只有 25 个(http://hereditaryhearingloss. org)。2000年7月，王晓东实验小组首次报道从HeLa细胞中分离出一种新型线粒体蛋白质，命名为第2个线粒体衍生的胱胺酸蛋白酶激活剂，即Smac (second mitochondria-derived activator of caspase)。同时，Vaux 实验小组报道从293T细胞中分离出一种蛋白质，命名为低等电点凋亡抑制蛋白(IAPs)直接结合蛋白(direct IAP binding protein with low PI, DIABLO)经过对比分析 Smae 和 DIABLO 完全等同，合并称为 Smac/DIABLO。免疫分析确定 Smac/DIABLO 定位于线粒体内，参与线粒体途径的凋亡。当细胞受到凋亡剌激(包括抗癌药物、电离辐射、化学信号和DNA 损伤)时，伴随细胞色素C由线粒体释放到胞质中，与抑制caspase活性的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)作用，达到促进凋亡的作用(参见Espinosa M，Cantu D，Lopez CM，De Ia Garza JG，Maldonado VA, Melendez-Zajgla J. SMAC is expressed de novo in a subset of cervical cancer tumors. BMC Cancer，2004，4 :84.)。Smac/DIABLO 可与现已发现的所有IAPs结合消除凋亡蛋白抑制物的作用以提高caspase活性，其功能与果蝇凋亡蛋白 ReaPer、Hid、Grim 相似，但其基因顺序明显不同D Smac/DIABLO是线粒体中的正常蛋白，在细胞凋亡时 Smac/DIABLO释放入细胞浆中，Smac/DIABLO的促凋亡活性需线粒体的参与。Smac/DIABLO 的过度表达可提高细胞对凋亡剌激如紫外线照射、化疗药物等的敏感性。Smac/DIABLO多妝包含239个氨基酸，经PCR及westernblot、northernblot检测，Smac/DIABLO在人正常组织心、肝、肾、脾、前列腺、胸腺、肠等中有较高度表达。Cheng 等(2011)研究发现Smac/DIABLO包含7个外显子，同时发现在人类的胚胎组织(妊娠17周) 中Smac/DIABLO广泛表达，高表达在睾丸、肾上腺和耳中。在发育的小鼠耳蜗中，从E18. 5 到PO Smac/DIABLO在毛细胞中被显著上调。Smac/DIABLO在小鼠内耳发育的不同阶段的广泛分布及毛细胞中的特异富集，都表明Smac/DIABLO的功能与内耳和毛细胞的发育和内稳态密切相关。Cheng 等(2011)将中国一个六代相传耳聋家系的致病基因定位于一个新的常染色体显性遗传非综合征型耳聋基因位点，人类基因组命名委员会(HUGO)将其命名为DFNA64，通过直接测序找到与耳聋表型共分离的Smac/DIABLO基因c. 377C > T杂合突变。Smac/DIABLO是线粒体内膜上非常重要的细胞凋亡相关蛋白，直接参与cytC/APAFl/CASP9凋亡通路中促细胞凋亡的发生。该研究还发现Smac/DIABLO的p. S126L突变体可引起细胞内野生型和突变型Smac/DIABLO大量降解，引发线粒体膜电位慢性损伤。进一步的研究需要在动物模型中验证和分析突变型Smac/DIABLO对内耳毛细胞的损伤作用。目前国际上尚未见此类动物模型的报道。因此，建立一种Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠的动物模型以实现模拟人类耳聋疾病(DFNA64)的相关研究势在必行。
技术实现思路
针对目前耳聋疾病研究中存在的问题，本专利技术的目的是克服在人体研究中的不可操作性，构建Smac/DIABLO基因突变转基因载体；本专利技术的再一目的是利用该转基因载体， 通过原核注射和胚胎移植技术，提供一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型。本专利技术所述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，步骤是(I)利用pcDNA3. I (+)构建载体将Smac/DIABLO基因的cDNA序列连入载体 pcDNA3. I (+)的KpnI和BamHI两个酶切位点之间，将IRES-eGFP序列连入载体pcDNA3. I (+) 的EcoRV和XhoI两个酶切位点之间；设计诱变引物扩增PCR引入c. 371C > T突变；经过测序验证突变后，用KpnI和XhoI双酶切已诱变的质粒中的cDNA+IRES-eGFP片段和空质粒 pcDNA3. I (+)，再进行连接、转化、培养、提质粒，构建得到Smac/DIABLO基因突变型载体质粒-pcSIG,所述pcSIG质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；其中，上述诱变引物序列是 M371-F GAAGATGAATTTCCAGGAGGAAG,M371-R CCAAGTAAAC TTGTATATTGTCGGT ；(2)原核注射和胚胎移植建立转基因小鼠模型将突变型载体质粒pcSIG线性化， 通过显微注射注入合子的原核中，37°C培养I 3h，然后将注射质粒并培养存活的合子移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；其中，上述PCR扩增引物序列是cDNA-F GCGGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高建刚，张剑，袁慧军，卢宇，程静，朱玉华，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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