肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及稳定剂，所述第一反应液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。本发明专利技术还提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的使用方法，所述方法具有快速准确、特异性强、操作简便且不会出现假阳性的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测试剂盒，具体涉及一种肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒和及其使用方法。
技术介绍
2011年5月德国暴发了大规模肠出血性大肠杆菌0104 :H4疫情，波及部分欧洲国家以及美国、加拿大等国家，短时间内感染人数超过4000，少数病例继发溶血性尿毒综合征 (HUS)，导致多器官受损，甚至有30多人死亡。肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage E. Coli, EHEC)是大肠杆菌的一个亚型， 其可引起严重的食源性疾病。常见的肠出血性大肠杆菌(EHEC)血清型有3个0157、026、 0111，不常见的血清型有40多种，而0104: H4是EHEC家族中的一种罕见的血清型，其含有志贺毒素2(vtx2a)的基因和肠积聚性黏附大肠杆菌毒力质粒上的3个基因aatA，aggR和 aap0鉴于肠出血性大肠杆菌0104:H4危害的严重性以及其影响的广泛性，快速准确地对其进行检测将具有十分重要的意义。培养法是国际上通用的鉴定细菌的方法，参照肠出血性大肠杆菌0157:H4检测方法《SN/T 0973-2010进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌0157:H7检测方法》，肠出血性大肠杆菌0104:H4采用培养法检测步骤如下(I)增菌无菌操作将待检样品放入增菌肉汤中，培养18小时-24小时。(2)分离对⑴增菌肉汤进行10倍递增梯度稀释，从ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6稀释液中各取O. ImL增菌肉汤滴加于SMAC平板或(和)科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上，以灭菌L棒进行涂布并置于36°C ±1°C培养18小时-24小时。在SMAC平板上可疑肠出血性大肠杆菌菌落呈淡褐色中心，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm。在科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上可疑肠出血性大肠杆菌菌落呈紫红色。(3)生化试验和血清学鉴定从SMAC平板或科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上挑选不少于5个-8个可疑菌落， 进行生化鉴定和血清凝集试验。(4)结果报告根据选择性分离平板、生化试验和血清学鉴定结果，报告样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌0104: H4。传统的针对肠出血性大肠杆菌0104:H4的培养检测法存在操作周期长、工序繁琐、易污染及所需试剂繁多等缺点，传统培养法已无法满足快速检测肠出血性大肠杆菌 0104 :H4的需要。因此需要开发一种能快速准确地检测肠出血性大肠杆菌0104:H4的检测试剂盒来满足当前需要。
技术实现思路
针对现有技术中的检测周期长、工序繁琐、灵敏度低等缺点，本专利技术提供一种能快速准确地检测肠出血性大肠杆菌0104:H4的检测试剂盒。本专利技术的目的通过以下技术手段得以实现一种肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包含以wzy(0104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy (0104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。本专利技术还提供一种肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤提供待检测样品；进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测使用本专利技术的肠出血性大肠杆菌 0104:H4检测试剂盒进行，所述荧光定量PCR检测包含阴性对照检测和阳性对照检测。本专利技术提供的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒及其使用方法，利用荧光定量PCR技术针对肠出血性大肠杆菌0104:H4的特异基因wzy (0104)、fliC(H4)和aggR基因进行检测，避免了传统培养检测法中的操作周期长、所需试剂繁多、对操作者主观性依赖等缺点，本专利技术将检测时间由传统培养检测法的36小时以上缩短为5小时左右，且只需短时间接触病菌而增加了操作者安全性，并具有操作简便且不会出现假阳性等优点。附图说明图I为本专利技术使用的Ct值的示意性说明，其中所述的阈值线对应于特定探针；图2为使用本专利技术的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒进行检测的流程图；图3为使用本专利技术的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒进行检测的阳性对照的结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、ROX ；图4为使用本专利技术的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒进行检测的阴性对照的结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、ROX ；图5为使用本专利技术的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒进行检测得到的荧光定量PCR结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、R0X。具体实施例方式以下缩略语适用于本专利技术PCR Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应Tris :三异丙基乙磺酰EDTA ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate,脱氧核糖核苷三憐酸FAM :CarboxyfIuorescein,竣基突光素HEX :hexachloro_fIuorescein,六氣突光素ROX :Carboxy-X-rhodamine,羧基-X-罗丹明DABCYL :4,4-Dimethylamino-azobenzene_4 ' carboxyl ic acid,4_ 二甲胺偶氮苯-4’ -羧酸Ct cycle threshold,每个PCR反应管内的突光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，参见图I。本说明书中使用的术语“浓度”，如非特别说明，均指初始浓度，即与其它液体混合之前的浓度。荧光定量PCR技术在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行， PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1， 在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。基于以上技术，本专利技术的肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒针对EHEC 0104:H4三个基因wzy(0104)、fliC(H4)和aggR设计特异性引物和探针，在反应体系中含有wzy (0104)、f IiC (H4)和aggR基因DNA模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本专利技术实施例提供一种肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及稳定剂，所述第一反应液包含以 wzy (0104), fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy (0104)基因的引物探针、f I iC (H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。优选地，本专利技术实施例肠出血性大肠杆菌0104:H4检测试剂盒中，上述wzy(0104)基因的引物探针为wzy (0104)基因的引物49F:5’ -TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’ (SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢柳燕，吴成贡，龚剑，董绍旺，田仁鹏，汪再兴，黄娟，
申请(专利权)人：深圳市生科源技术有限公司，
类型：发明
国别省市：