本发明专利技术公开了一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物，所述引物包括三对引物，其中，用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示；用于犬细小病毒检测的引物序列分别为SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示；用于I型和II型犬腺病毒检测的引物序列为SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示。采用本发明专利技术引物通过多重PCR的方法可以同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒多重PCR方法的引物，属于病毒的检测领域。
技术介绍
犬痕热病毒(Caninedistemper virus, CDV)、犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)和犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)是引起犬发病的主要病原，这3种病毒单一或混感后临床致死率可达50% -100%，给养犬业造成巨大经济损失。临床上，⑶V引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型四种，CPV主要引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。CAV根据其血凝和中和试验等特性不同可将 CAV分为I型和2型，即CAV-I和CAV-II。。CAV-I在临床上可导致犬传染性肝炎、狐狸和熊脑炎的发生。CAV-II引起犬、狐传染性喉气管炎。犬的这几种主要疾病临床症状相似，并常有混合感染，给诊断造成困难。常用的单项PCR方法耗时长，有必要建立快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。鉴于此，本试验建立了⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II的多重 PCR检测方法，为临床检测提供保障
技术实现思路
本专利技术所要解决的结束问题是克服现有技术的不足，提供一套可用于检测犬瘟热病毒野毒株的RT-LAMP引物。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的本专利技术的一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR 检测引物，其特征在于所述引物包括三对引物，其中，所述的用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述的用于犬细小病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒检测的引物序列为 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。本专利技术还提供了一种检测犬瘟热病毒(⑶V)、犬细小病毒(CPV)、1型和II型犬腺病毒(CAV-I、CAV-II)的方法，其特征在于包括以下步骤配制25 ii L PCR 反应体系10X Ex Buffer 2. 5 U L, dNTPs 2 U L, Ex Taq DNA 聚合酶 0. 25 u L、CDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L、CPV-NSl 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV-E31 和 CAV-E32 各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV-1 模板 0. 75 u L、CAV-II 模板 I. 5 u L、灭菌 ddH20 13. 5 u L ；其中，引物⑶V-Nl和⑶V-N2用于犬瘟热病毒的检测，其序列分别为SEQ IDNO : I 和SEQ ID NO :2所示；引物CPV-NSl和CPV-NS2用于犬细小病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示； PCR 反应程序94°C预变性 5min ;94°C变性 30S，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30个循环；72°C延伸IOmin ；观察取L PCR产物，经I %琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。进一步的，本专利技术还提供了一种用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，其特征在于包含本专利技术所述的引物。更进一步的，本专利技术还提供了所述的引物在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I 型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。以本专利技术所设计的引物采用多重PCR检测方法对⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II进行检测，检测结果均为阳性，而对其他常见犬源性病毒检测结果均为阴性。应用本专利技术引物序列采用多重PCR方法，可以同时检测⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本专利技术所设计的引物序列在发病犬早期检测和快速诊断中具有重要意义。附图说明图I为多重PCR扩增结果；I :阴性对照；2 CDV ；3 CPV ；4 CAV-I ；5 =CAV-II ；6 CDV+CPV+CAV-I+CAV-II ；M DL 2000 DNA Marker图2为多重PCR特异性试验结果；I CDV ；2 CPV ；3 CAV-I ；4 =CAV-II ；5 :CDV+CPV+CAV-I+CAV_II ；6 RV ；7 阴性对照；M DL 2000DNA Marker图3为多重PCR敏感性试验结果。M DL 2000DNA Marker ;1 :阴性对照；2 10_1 ；3 :1(T2 ；4 :1(T3 ；5 :1(T4 ；6 :1(T5 ；7 1(T具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例II材料和方法I. I病毒株⑶V株、CPV株、CAV-I、CAV-II株及狂犬病毒(RV)株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。I. 2主要试剂Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000DNA Marker、M-MLV 酶和 RNA 酶抑制剂购自购自宝生物工程(大连)公司；DNA提取试剂盒购自Omega公司；RNA提取试剂盒购自Qiagen 公司。I. 3引物设计分别根据GenBank中CBVN基因序列、CPVNS基因序列和CAV E3基因序列，设计3 对特异引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列见表I。表I多重PCR引物序列引物_序列(5'-3')._长度(bp)TGCGGTCTTACATTTGCATC ( SEQ ID NO. I )CDV507ACTCCAGAGCAATGGGTAGGG ( SEQ ID N0.2 )CPVATGGTTGGTGACTCTTTGTTT ( SEQ ID N0.3 )287ACATTTGATTGACACTTCCC ( SEQ ID N0.4 )CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC ( SEQ ID N0.5 )CAV-I/II 590/1027 _CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT ( SEQ ID N0.6 )_I. 4RNA 和 DNA 的提取按RNA提取试剂盒和DNA抽提试剂盒说明书分别提取病毒RNA和病毒DNA。I. 5多重PCR方法建立以CDV的cDNA和CPV、CAV-I, CAV-II的DNA混合物作为多重PCR的模板，建立 PCR 反应。采用 25 ii L 反应体系10 X Ex Buffer 2. 5 u L, dNTPs 2 u L, Ex Taq DNA 聚合 SI 0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘大飞，张洪英，曲连东，林欢，姜骞，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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