一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法技术

一种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法，属于显微组织切片技术领域。其包括：1）材料前处理；2）样品固定；3）冷冻切片；4）展片；5）染色；6）显微观察与拍照。本发明专利技术显著缩短了样品固定、切片和染色的时间，基本上12小时左右即可完成样品前处理到荧光显微镜下观察拍照的整个过程，而且本发明专利技术得到的切片组织结构完整、图像清晰，同时也有效解决了徒手切片材料组织易碎、切片厚薄不匀，石蜡切片过程繁琐、周期长等问题，工作效率极显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于显微组织切片
，具体涉及ー种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法。
技术介绍
植物維管束系统由韧皮部和木质部组成，是贯穿整个植株体内的主要输导组织，承担着植株体内的长距离运输，是植物输送光合产物、水分和矿质营养的通道。韧皮部组织由筛管、伴胞和薄壁细胞组 成，韧皮部筛管中含有胼胝质、胼胝质合成酶、韧皮蛋白等多种物质，在筛管的代谢中起着重要调节作用。胼胝质(callous)(主要成分为β-1，3-葡聚糖)的合成、分解直接关系到植物正常的生长代谢过程，在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用。研究表明，机械损伤、病原菌侵染、害虫为害等外界逆境胁迫可诱导植物细胞合成胼胝质(Jaffemet al，1984)，而且胼胝质的积累与植物抗病、抗虫特性有关(田国忠等，1994 ；Ecaleet al.，1995，1999 ；Serranoet al.，1998)。植物组织切片方法种类多，每ー种切片法都各有特点和局限性，常用有徒手切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等。徒手切片法即用剃须刀切割材料，难以切得很薄、易产生厚薄不匀现象，难以获得完整的切片；石蜡切片法虽是最常用的方法，但由于材料切片前需经过固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，易使材料变脆、变硬和变形，过程繁琐、周期长；冷冻切片法是利用冷冻切片机使材料冷冻后进行切片的ー种快速方法。目前，植物组织中胼胝质的检测常用苯胺蓝染色法(李师翁等，1990;Adrienneet al. , 2005; Penet et al. , 2005 ；申业等，2006 ; 丁新伦等，2008)，也有用改良苯酚品红-苯胺蓝压片法(刘晓瑞等，2008)，主要观察植物叶片组织受病虫害等逆境胁迫后和植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质的动态变化。丁新伦等(2008)采用徒手切片法及苯胺蓝荧光染色技术研究了水稻条纹病毒(RSV)胁迫下杭、感水稻品种叶片中胼胝质沉积的影响。所用方法为对稻苗叶片组织做徒手切片，再在96%こ醇中浸泡过夜，置于磷酸缓冲液(O. 07mol/L, pH=9)中 30 min，用 O. 005% 苯胺蓝(O. 07mol/L, pH=9)染色 60 min, 20%甘油封片，最后在Olympus荧光正置显微镜下用紫外光激发观察。但徒手切片难以切得很薄、易产生厚薄不匀现象。由于水稻叶片组织与叶鞘组织中含水量不同，而且叶鞘组织的细胞腔大而壁薄，取样后叶鞘组织中常有气泡存在，无法用徒手切片，切片易破碎不完整，难以获得完整的组织结构。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种用于观察叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法的技术方案。所述的ー种用于观察水稻叶鞘组织胼胝质的叶鞘组织制片方法，其特征在于包括以下エ艺步骤I)材料前处理取分蘖期的水稻叶鞘组织，洗浄擦干后迅速用刀片切成O. 3 O. 5 Cm的小段，然后立即放入10%的甘油溶液中，并用真空泵抽气10 20 min,直至叶鞘组织下沉为止； 2)样品固定在冷台底座先加I滴组织冷冻胶，再将步骤I)得到的叶鞘组织小段垂直置于平放的冷台上，再加2 5滴组织冷冻胶将叶鞘组织小段完全包裹住，并放在冷冻切片机中的样品台上，放置100 140 min后，即可用于冷冻切片； 3)冷冻切片将粘有叶鞘组织小段的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上，拧紧固定螺丝，并将切片厚度调节旋钮调至切片厚度 ο μ m，箱体最低控制温度为-40°c，切片头最低控制温度为_50°C，摇动旋转手轮进行切片； 4)展片先将载玻片靠近切片刀，每切一张切片，用毛笔轻轻地将切片移到载玻片上，每块载玻片贴上15 20张切片； 5)染色贴好切片后，在室温下让冷冻胶稍稍干燥，放入96%酒精浸泡6 10小时后，取出并将酒精晾干，再加入I ml浓度为1/15 mol/L、pH值为7. O的磷酸缓冲液于切片上，45 min后再加I ml浓度为O. I mol、pH值为7. O的苯胺蓝染色液，染色60 min后将载玻片缓慢倾斜倒掉染色液； 6)显微观察与拍照待切片刚刚干燥时，立即在OlympusBX51荧光正置显微镜下用紫外光激发观察到叶鞘组织中的胼胝质，并用该显微镜专用的照相机进行拍照。所述的，其特征在于所述的步骤I)中真空泵为SHZ-CA型循环水式多用真空泵。所述的，其特征在于所述的步骤2)中叶鞘组织小段垂直置于平放的冷台前，先用擦镜纸将其表面上的残余液体吸干。所述的，其特征在于所述的步骤3)中冷冻切片时如冷刀上的霜层较厚，应及时启动除霜程序以除去切片刀上的霜层以防卷片。本专利技术显著缩短了样品固定、切片和染色的时间，基本上12小时左右即可完成样品前处理到荧光显微镜下观察拍照的整个过程，而且本专利技术得到的切片组织结构完整、图像清晰，同时也有效解决了徒手切片材料组织易碎、切片厚薄不匀，石蜡切片过程繁琐、周期长(通常需要2周时间)等问题，工作效率极显著提高。附图说明图I荧光显微镜下观察到的水稻叶鞘组织横切面的超微结构(210倍)； 图2荧光显微镜下维管束系统中叶鞘组织维管束的超微结构(放大820倍)； 图3荧光显微镜下维管束系统中维管束筛管中胼胝质的超微结构(放大820倍)。具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本专利技术。实施例水稻品种和生育期TN1、苗期试验时间2011年5-12月 试验地点浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所植保工程研究室 试验方法材料前处理、固定样品、冷冻切片、展片、染色和观察拍照等过程。I)材料前处理取苗期的水稻叶鞘组织，轻轻洗净后擦干后迅速用刀片切成O. 3 O. 5 Cm的小段，立即放入10%的甘油溶液中，用SHZ-CA型循环水式多用真空泵抽气10 20 min,优选为15 min,直至叶鞘组织下沉为止。2)样品固定将叶鞘组织取出，放在擦镜纸上将其表面上的残余液体吸干，在冷台底座先加一滴冷冻切片机(Leica CM 1900 Cryostat ；Leica Microsystems NusslochGmbH, German)专用的组织冷冻胶(Jung Tissue Freezing Medium ),再将切好的叶鞘组织小段垂直置于平放的冷台上，再加2 5滴组织冷冻胶将叶鞘组织完全包裹住，放在冷冻切片机中的样品台上，放置100 140 min后，优选为120 min，即可用于冷冻切片。3)冷冻切片将粘有叶鞘组织的冷台固定在冷冻切片机(Leica CM 1900Cryostat ；Leica Microsystems Nussloch GmbH, German)的冷台固定槽上,抒紧固定螺丝，并将切片厚度调节旋钮调至切片厚度10 μ m,箱体最低控制温度为-40°c，切片头最低控制温度为-50V。摇动旋转手轮进行切片。其间如冷刀上的霜层较厚，应及时启动除霜程序以除去切片刀上的霜层以防卷片。4)展片先将载玻片以合适的角度靠近切片刀，每切一张切片，用毛笔轻轻地将切片移到载玻片上，每块载玻片贴上15 20张切片。5)染色贴好切片后，在室温下让冷冻胶稍稍干燥，放入96%酒精浸泡8 10小时后，取出将酒精晾干，加入I ml浓度为1/15 11101/1、？!1值为7.0的磷酸缓冲液于切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建明，杨丽，张珏锋，何月平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：