本发明专利技术公开了辣椒CaCOI1.2基因，开放读码框序列由SEQIDNo.1中第186位至第1997位核苷酸组成，还公开了含有辣椒CaCOI1.2基因的重组表达载体和转化体，以及辣椒CaCOI1.2基因在大果实辣椒植株育种中的应用和具体的应用方法，研究结果显示，通过农杆菌介导将携带辣椒CaCOIl.2基因的超表达载体转入新苏椒王品系辣椒，所得转基因阳性植株的辣椒果实大小较非转基因辣椒植株明显增大，从而显著提高了辣椒产量；由于CaCOI1.2基因为辣椒自身基因，将其转入辣椒植株中获得的转基因植株也不存在影响环境安全和食用安全的问题；本发明专利技术构建的辣椒转基因方法转化效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及ー种基因，还涉及该基因的重组表达载体和转化体，以及该基因的应用和具体应用方法。
技术介绍
辣椒为茄科的ー种重要农作物，在世界范围内广泛栽培。辣椒也是ー种重要的调味品，通常和其它调味物共同运用在泡菜、烤肉等食物中。辣椒营养价值高，富含维生素A、B、C、D、E以及多种矿物质元素如钥、锰、钾等。从辣椒中提取的辣椒碱还具有药用价值，对腰椎痛、神经痛、风湿痛以及过敏性鼻炎等都有一定治疗作用。虽然传统的植物育种在改良农作物(如质量性状)的过程中做出了巨大的贡献，但常规育种在筛选优良品种时难度大、耗时长，已经不能满足辣椒生产的需要。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程育种已成为育种领域的ー个重要分支，在定向改良辣椒特性方面也显示出极大的潜力。但目前，利用转基因技术增加辣椒的抗病虫、抗除草剂和抗盐碱性能的报道相对较多，而有关辣椒增产的报道很少。此外，由于辣椒较其它茄科植物而言再生率偏低且不稳定，转化效率低，目前对大多数辣椒品种和不同的外植体还没有ー个普遍适合的转化模式，也相应增加了利用转基因技术定向改良辣椒性状的难度。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之ー在于提供ー种与辣椒花器官发育相关的基因，目的之ニ在于提供含有该基因的重组表达载体，目的之三在于提供含有该重组表达载体的微生物转化体，目的之四在于提供该基因在大果实辣椒植株育种中的应用，目的之五在于提供利用该基因获得大果实辣椒植株的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案 I.辣椒J基因，开放读码框序列由SEQ ID No. I中第186位至第1997位核苷酸组成。进ー步，所述辣椒CaCOIL 基因的mRNA全长序列由SEQ ID No. I中第I位至第2041位核苷酸组成。2.含有所述辣椒CaCOIl. 2基因的重组表达载体。进ー步，所述重组表达载体是将辣椒基因的开放读码框序列插入载体PBI121的多克隆位点中而获得的超表达双元载体pBI121-CaC0Il. 2。3.含有所述重组表达载体的微生物转化体。进ー步，所述微生物为农杆菌。4.所述辣椒基因在大果实辣椒植株育种中的应用。5.利用所述辣椒CaCOIl. 2基因获得大果实辣椒植株的方法，包括如下步骤 a.辣椒外植体的制备将辣椒种子用体积分数为75%的こ醇溶液消毒，无菌水冲洗，再用饱和磷酸钠溶液浸泡，无菌水冲洗，最后用体积分数为1%的次氯酸钠灭菌，无菌水冲洗，蒸馏水浸泡，播种于1/2 MS培养基上，在温度为20±2°C、光周期为16 h/d和光照强度为1000-2000 Ix的条件下培养；取培养12天的辣椒幼苗，剪掉子叶的两端部分，同时将下胚轴剪成长0. 8^1. 2 Cm的小段，选取子叶和下胚轴小段接入预培养培养基上，在20±2°C、黑暗条件下预培养I天，作为外植体；所述1/2 MS培养基含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 6-0. 8%的琼脂，pH为5. 8 ;所述预培养培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、I mg/L的玉米素和0. 2 mg/L的吲哚こ酸，pH为5. 8 ; b.辣椒CaCOIl.基因农杆菌工程菌液的制备将含有超表达双元载体pBI121-CaCOIl. 2的根瘤农杆菌LBA4404菌株接种于YEB固体培养基上，在28±2°C、黑暗条件下培养2天，挑取单菌落，用YEB液体培养基培养2-3天，再按照体积比为0. 01:1将所得菌液加入YEB液体培养基中过夜扩大培养至OD_为I. 8-2. 0 ，室温下6000 rpm离心，弃上清，用YEB液体培养基重悬菌体，室温下6000 rpm离心，弃上清，用等体积的MS盐溶液重悬菌体，即得辣椒CaCOIl. 2基因农杆菌工程菌液；所述超表达双元载体pBI121-CaCOIl. 2是将辣椒基因的开放读码框序列插入载体pBI121的多克隆位点中而获得；所述YEB固体培养基含有质量分数为I. 5%的琼脂、50 mg/L的卡那霉素、500 mg/L的链霉素和50 mg/L的利福平，pH为7. 0 ;所述YEB液体培养基含有50 mg/L的卡那霉素、500 mg/L的链霉素和50 mg/L的利福平，pH为7. 0 ;所述MS盐溶液的pH为5. 8 ; c.农杆菌的侵染转化将步骤a制得的辣椒外植体浸入步骤b制得的辣椒CaCOIl.2基因农杆菌工程菌液中浸染10-23分钟，接入共培养培养基，在20±2°C、黑暗条件下培养2-3天，再转入抗性选择培养基，在25±2°C光照16小时、18±2°C黑暗8小时和1000-2000Ix光照強度的条件下培养至长出抗性不定芽，再将抗性不定芽转入延长选择培养基，在25±2°C光照16小时、18±2°C黑暗8小时和1000-2000 Ix光照强度的条件下培养至形成新的植株，再将新的植株切段，所得茎段接入选择生根培养基，在25±2°C光照16小吋、18±2°C黑暗8小时和1000-2000 Ix光照强度的条件下培养至生根，获得转基因辣椒植株；所述共培养培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、I mg/L的玉米素和0.2 mg/L的吲哚こ酸，pH为5.8 ;所述抗性选择培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.2 mg/L的吲哚こ酸、5 mg/L的硝酸银、5 mg/L的6-节氨基嘌呤、500 mg/L的羧节青霉素和50 mg/L的卡那霉素,pH为5. 8 ;所述延长培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、0. 5 mg/L的生长素、5 mg/L的硝酸银、5 mg/L的6-节氨基嘌呤、2 mg/L的赤霉素、500 mg/L的羧节青霉素和50 mg/L的卡那霉素，pH为5. 8 ;所述选择生根培养基为MS培养基，含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0. 8%的琼脂、0. I mg/L的吲哚こ酸、0. 2 mg/L的萘こ酸和50 mg/L的卡那霉素，pH为5.8 ; d.大果实辣椒植株的获得从步骤c获得的转基因辣椒植株中筛选出转基因阳性植株，即得大果实辣椒植株。进ー步，步骤d分别采用PCR和半定量RT-PCR方法筛选转基因阳性植株，所述PCR方法以超表达双元载体pBI121-CaC0Il. 2中NPTII报告基因的特异性引物NPTII-f和NPTII-r为扩增引物，所述NPTII-f和NPTII-r的序列分别如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；所述半定量RT-PCR方法以辣椒2基因与非转基因辣椒基因组同源性较低片段的特异性弓I物CaCOI 1-df和CaCOII-dr为扩增引物，并以Actin基因为内參基因，所述CaCOI 1-df和CaCOI 1-dr的序列分别如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示,AcUn基因特异性引物Actin-f和Actin-r的序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。进ー步，所述辣椒品系为新苏椒王。 本专利技术的有益效果在于本专利技术根据拟南芥与番茄的基因对控制花器官发育具有一定影响，且番茄与辣椒亲缘关系较近的特点，克隆得到辣椒基因mR本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡廷章，曾华，陈国平，胡宗利，王贵学，杨勇卫，谭丽莉，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：
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