本发明专利技术公开了一种1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体及其基因与用途，本发明专利技术的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体，具有催化3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇的活性，为含有Q202H突变的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶。所得到的变体基因通过酶动力学曲线的测定，与1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因相比较，催化效率显著提高，为1，3-丙二醇的生物生产提供了广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工中的基因工程菌生产1，3_丙二醇化工原料的
，尤其涉及一种催化3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体及其用途。
技术介绍
1，3_丙二醇是重要的溶剂和化工原料，以其作为单体可用来合成性能优良的聚酯、聚氨酯等缩聚物。近来，由于以1，3_丙二醇和对苯二甲酸为单体合成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)具有非常独特的性质，所以受到国外许多研究机构的重视。目前，化学法合成 I，3-丙二醇专利由荷兰壳牌(Shell)化学公司和德国Degussa拥有。而生物转化合成I, 3-丙二醇专利则由美国杜邦(DuPont)公司和德国国家生物技术中心获得。如1999年杜邦公司与世界第二大工业酶生产商Genencor公司联合申请了以葡萄糖为底物用基因工程菌直接生产1，3_丙二醇的专利。生物转化法具有耗能低，可利用可再生资源、清洁生产、成本低等优点，但由于在微生物代谢途径中与合成1，3-丙二醇相关的酶的催化效率低下，迄今为止，生物合成1，3_丙二醇的产量仍无法与化学合成法的产量相比。在生物转化甘油合成 1，3_丙二醇的代谢途径中，需要甘油脱水酶和1，3_丙二醇氧化还原酶，其中甘油脱水酶负责将甘油转化成中间产物3-羟基丙醛，而I，3-丙二醇氧化还原酶则负责将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。由于1，3-丙二醇氧化还原酶在催化过程中催化活性很差，严重限制了生物转化合成1，3-丙二醇的大规模生产。最近发现在大肠杆菌K12体内存在一个1，3-丙二醇氧化还原酶的同工酶(其对应基因为yqhD)，是甘油代谢途径中可代替1，3_丙二醇氧化还原酶催化中间产物3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇另一关键酶，由其代替1，3-丙二醇氧化还原酶的催化效率明显高于1，3-丙二醇氧化还原酶的催化效率。本专利专利技术人在先的专利申请CN20071017175812和CN200710171759. 6中也曾公开了在1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的基础上利用突变定向进化技术获得催化3-羟基丙醛活性更高的变体酶，但提高程度有限，生物转化合成1，3-丙二醇的大规模产业化还有一定困难。
技术实现思路
本专利技术公开了一种能催化3-羟基丙醛生成化工原料1，3_丙二醇的1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶突变体及其基因与用途。本专利技术的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体是发生了 Q202H突变的1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶。本专利技术在1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶基因的基础上，通过在202 氨基酸位点进行饱和突变定向进化技术介导的随机突变，筛选获得催化活性获得进一步提高的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体。其编码碱基的序列如序列表中SEQ ID NO. I 所示，原1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因中编码第202位的天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子。所得到的变体基因通过酶动力学曲线的测定，与1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶基因相比较，催化效率显著提高，为1，3_丙二醇的生物生产提供了广阔的应用前景。本专利技术一方面公开了一种1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶突变体，具有催化3-羟基丙醛生成I，3-丙二醇的活性，为含有Q202H突变的I，3-丙二醇氧化还原酶同工酶。进一步的，所述1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶突变体的氨基酸序列由SEQ IDNO I所示序列所编码。本专利技术第二方面公开所述1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体的基因，其序列如 SEQ ID NO 1 所示。本专利技术第三方面公开了所述1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶突变体用于生产1， 3-丙二醇的用途。进一步的，所述1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶突变体用于将3-羟基丙醛催化生成1，3-丙二醇。本专利技术的优点是创造了一种对3-羟基丙醛具有更高催化活力的I，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因，其突变位点为Gln202Hi s (Q202H)，与I，3-丙二醇还原酶同工酶基因相比较，活性显著提高，上升了近2. 5倍。该变体基因的获得为化工原料1，3_丙二醇的生物生产提供了广阔的应用前景。具体实施例方式本专利技术采用饱和突变定向进化技术进化1，3_丙二醇氧化还原酶同工酶基因，通过在202氨基酸位点设计一对引物，这对引物在设计过程中在202氨基酸位点能够引入随机的突变，对模板质粒PET28 a (+) yqhD退火后，通过高保真度的Pfu聚合酶进行PCR扩增， 然后转化到E. Coli Novablue中，涂布到含有40 μ g/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37°C过夜培养得到相应的突变体库。从突变体库中挑取克隆接种到300 μ L含有40 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37°C过夜培养，取40 μ L该过夜培养液加入到一个新的800 μ L含有30 μ g/ mL卡那霉素的LB液体培养基的I. 2mL容积的96微孔板中，在37°C培养至0D_为O. 5 O.7时，加入IPTG (终浓度O. 5mmol/L)诱导并在30°C继续培养28h，4000r/min离心半个小时收获细胞，用300 μ L的ρΗ7. 5磷酸盐裂解缓冲液重悬细胞，在37°C培育30min后，立即置于_80°C冷冻30min,室温解冻,4000r/min离心30min,吸取300 μ L上清液到一个新的96 微孔分析板中，加入2 μ L200mmol/L 3-羟基丙醛底物(3-羟基丙醛溶解在DMSO中)，在室温下培育1011^11，然后加201^ 2mg/mL的NADPH启动反应，在340nm处在线监控吸收值的变化5min，筛选出酶活力高于原酶的菌株并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为 Gln202Hiso以下列举具体实施例，应理解，实例并非用于限制本专利技术的保护范围实施例I饱和突变引物的设计和PCR扩增产物的获得上游引物5’ -ACACCGTGGAANNNTATGTTACCAAACC-3’ (SEQ ID NO 2)下游引物5’ -GGTTTGGTAACATANNNTTCCACGGTGT-3’ (SEQ ID NO 3)向500 μ L的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大约2ng ρΕΤ28α (+) yqhD (为将yqhD克隆入ρΕΤ28 α (+)载体获得，已有多篇文献报道)作为模板DNA，2. 5U PfuDNA聚合酶，5 μ L的含有25mmol/L的MgCl2的所Pfu PCR缓冲液，然后用无菌蒸馏水加至总体积50 μ L0反应参数是通过95°C变性Imin后，在95°C 30s, 52°C，lmin，72°C lmin，经过20个循环，然后72°C延伸2min，得到PCR扩增产物。突变文库的构建将上述PCR扩增后的PCR产物用DpnI消化2小时后转化到E. Coli Novablue中， 涂布到含有40 μ g/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37°C过夜培养得到相应的突变体库。对3-羟基丙醛具有高催化活性的变体基因的筛选从突变体库中挑取克隆接种到300 μ L含有40 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37°C过夜培养，取40 μ L该过夜培养液加入到一个新的800 μ L含有30 μ g/ mL卡那本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李红梅，王伟洁，邓龙华，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：
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