一株产D-乳酸动态调控重组菌及用其制备D-乳酸的方法技术

一株产D-乳酸动态调控重组菌及用其制备D-乳酸的方法，属于微生物基因工程技术领域。本重组菌命名为大肠杆菌（Escherichiacoli）B0013-070B，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2012071。该菌株其基因组中乳酸脱氢酶基因启动子ldhAp被替换为培养环境/营养因素控制型启动子。利用该重组菌，在25~50℃条件下分阶段发酵28~40h，产D-乳酸水平达12.5%；光学纯度达99.9%，化学纯度达98.4%。本发明专利技术对D-乳酸高产菌B0013-070染色体上的D-乳酸脱氢酶编码基因的表达进行动态调控，使得D-乳酸的生产过程仅需改变发酵温度即可控制，达到以葡萄糖为原料高效合成D-乳酸的目的。本发明专利技术经简单修改后，可用于其它工业上重要的微生物代谢产物的生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物法高效制备D-乳酸的发酵工艺及其发酵生产菌种，尤其是一种能够在工业化生产规模下，仅通过发酵工艺条件如温度因素的简单调控，实现D-乳酸高效合成和低成本发酵生产的工艺，属于微生物基因工程、生物化工和微生物发酵工程

技术介绍
乳酸(α -羟基丙酸，分子式为C2H5OCOOH)是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人、动物、植物和微生物中。乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，乳酸及其衍生物被广泛应用于酿造、食品、农业、医药、化工、纺织、皮革、烟草、印染等行业中。乳酸是自然界最小的手性分子，其羧基α位碳原子为不对称碳原子，具有L (+)和D (—)两种光学构型。异构体之一的D-乳酸是一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料。随着人们环保意识的提高，生物可降解聚乳酸材料的市场需求量剧增，也推动了对其单体D-乳酸的需求，同时促进了对以高产量、高转化率和高生产强度生产D-乳酸合成方法的需求。实现D-乳酸的快速高效合成需要两个条件一是菌体生长阶段，消除各种不利因素对菌体活性的影响，获得高活性的细胞工厂；二是D-乳酸合成阶段，菌体不生长或缓慢生长，副产物不合成，细胞工厂处于高强度合成D-乳酸状态。已有的研究多是为了实现上述目标。但是采用的方式或者是添加乙酸等物质(ZhuY. et al. , Applied Environmental Microbiology, 2007, 73: 456 464),或者是通入氮气等维持厌氧条件的气体(Zhu Y. et al. , Applied Environmental Microbiology,2007，73: 456 464)。而从工业化规模生产角度来讲，前者在乙酸等物质的流加控制上实现难度大，后者则需要维持发酵体系的密闭性，从而增加了设备成本和维护成本。本专利技术涉及的菌种可以通过环境条件的调整或改变，如温度的降低及提高；或营养物质添加或浓度变更，如乳糖或其结构类似物向培养基的添加；或特殊营养物质的浓度变更，如氧气(空气)的增减；或上述方法的组合，简易实现微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成途径的启动/关闭，来实现培养环境条件更适合细胞生长或更适合微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成，且该过程对环境因素无特殊要求。可以在工业规模生产中，仅通过简单的培养环境条件或因子，如温度的变化，方便地实现菌体的快速生长和微生物初级代谢产物，如D-乳酸的不合成；而在微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成过程中，其它种类的有机分子副产物不合成。在这一过程中，微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成速度还得到了大幅度加强。更为有益的是，该工艺发酵生产D-乳酸的过程在乳酸合成阶段对发酵体系的密闭性及无菌程度均无较高要求，甚至可以在开放环境中实现发酵生产。本专利技术涉及的发酵工艺和菌种，在微生物初级代谢产物如D-乳酸的工业化规模生产中意义显著，推广前景广阔。作为聚乳酸合成材料的单体，D-乳酸的光学纯度和化学纯度直接影响聚合材料的物理性能(Jem K. J. et al. , Microbiology Monographs, 2010, 14: 323 346)。因此，获得高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸显得尤为重要。野生大肠杆菌即可发酵产生较高光学纯度的D-乳酸(常在99%以上)，且其生长速度快、营养需求简单，但其化学纯度不高(常在80%以下)。因此，重组大肠杆菌是生物合成乳酸的主要菌种。与乳酸细菌相比，重组大肠杆菌进行D-乳酸发酵生产的优越之处在于其对乳酸的转化率常常可超过90% ;更重要的是，作为基因操作的工具菌，大肠杆菌遗传背景清楚、易于进行基因操作。通关定向遗传改良，可以使大肠杆菌在合成乳酸时的光学纯度和化学纯度皆能达到理想的程度。前期研究已有许多通过删除乳酸竞争途径来增加乳酸合成的报道(Zhou L.et al. , Current Microbiology, 2011, 62: 981 989 ;Zhu Y. et al. , AppliedEnvironmental Microbiology, 2007, 73: 456 464; Zhou S. et al. , AppliedEnvironmental Microbiology, 2003, 69: 399 407; Zhu J. et al. , AppliedMicrobiology and Biotechnology, 2004, 64: 367 375; Zhu J. et al., MetabolicEngineering, 2005, 7: 104 115)。进一步在重组大肠杆菌中增加乳酸合成关键途径乳酸脱氢酶基因的拷贝数或将其启动子替换为强启动子有可能会增加乳酸合成的速率。然而，Bunch 等(Bunch P. K. et al. , Microbiology, 1997, 143: 187 195)研究表明，在大肠杆菌中高表达D-乳酸脱氢酶基因，过量的乳酸脱氢酶将丙酮酸池转化为乳酸，使得三碳中间代谢产物缺乏，菌体生长受到抑制。此外，在菌体生长阶段产生乳酸会消耗大量的碳源，使得好氧阶段不能得到高菌体浓度，从而第二阶段的乳酸体积生产强度下降。如，我们前期报道的菌种 B0013-070 (Zhou L. et al. , Current Microbiology,2011，62: 98f989)在菌体生长阶段合成7 g/L乳酸，与细胞合成竞争底物，由于在大规模发酵过程中供氧能力会显著下降，好氧阶段乳酸的积累会进一步增加，从而影响菌体量的积累，使得在乳酸积累阶段乳酸体积生产强度降低。本专利技术建立了操作简易且能高效率制备高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸的发酵工艺。为了实现发酵操作过程的简洁性，本专利技术通过基因重组技术构建了一株利于发酵过程动态调控的生产菌种。本专利技术技术经过简单修改后，同样可以用于其它工业上重要的微生物代谢产物，但不限于，如L-乳酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸等多种有机酸；脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B12等多种微生物；或，乙醇、丙醇等短链醇的菌种构建与发酵生产新工艺技术的建立与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种操作简洁的高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸高效制备工艺，并获得一株与该工艺相对应的可以实现代谢过程动态调控的发酵生产菌种。本专利技术的技术方案一株产D-乳酸动态调控重组菌，其分类命名为大肠杆菌{Escherichia co7i)B0013-070B,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012071。所述产D-乳酸动态调控重组菌，其基因组中乳酸脱氢酶基因启动子7過如被替换为培养环境/营养因素控制型启动子。用所述产D-乳酸动态调控重组菌制备D-乳酸的方法，利用该重组菌，在25飞(TC条件下分阶段发酵28 40 h，产D-乳酸水平以g/mL计达到12. 59Γ13. 9%或以上；其先在发酵初期的6 15 h内，控制培养环境/营养因素，进行菌体的快速生长但不形成D-乳酸，然后在余下的发酵阶段，控制培养环境/营养因素，进行D-乳酸的快速合成； 所述控制培养环境/营养因素控制培养温度发酵初期的温度为25 36°C下利用葡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王正祥，周丽，田康明，沈微，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：