调控十字花科植物开花时间的物质和方法技术

本发明专利技术涉及调控十字花科植物开花时间的物质和方法。具体而言，本发明专利技术涉及含有SEQ?ID?NO：13所示序列的多核苷酸序列、含有该序列的多核苷酸构建物、转化体，调控十字花科植物开花时间的方法，以及所述序列或构建物的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于调控十字花科植物开花时间领域，具体涉及。
技术介绍
大白菜(Brassica rapa. pekinensis)是ー种重要的蔬菜作物,其营养生长阶段分为四个发育时期幼苗期、莲座期、包心期和结球期。这种二年生草本植物需要经历ー个冬天才能开花，植物经过低温处理后，到第二年春天开花，这个过程叫春化。在大白菜营养生长的任ー时期，只要有20-50天的低温环境(10°C以下)，植株就能通过春化作用进入生殖生长阶段。在生产上，“未熟抽薹”是造成大白菜产量和品质损失的一大难题，其原因是植株在结球期和结球期之前就通过春化作用而抽薹，导致植株无法结球和形成散球。为了保证产品器官-叶球的充分发育和产量形成，育种家往往将晚抽薹作为ー个重要育种目标，而栽培者则通过播种期的安排避免大白菜生殖生长阶段的到来。在拟南芥中，FLOWER LO⑶S C(FLC)作为ー种重要的开花抑制蛋白负调控春化作用，參与植株从营养生长向生殖生长的转化过程。拟南芥生态型Col自身FLC表达较弱，所以不经过春化也可以开花。但在ー些突变体中发现FLC表达会上调。通过对突变体的鉴定发现对FLC表达起促进作用的FRI，和对FLC表达抑制的FCA，FLD, LD, FVE。其中FRI (FRIGIDA)可协调mRNA 的 5’帽子结构与Paf (PolII-associated factor complex)的相互作用而起到修饰染色质的作用；FCA是个有RNA结合结构域的蛋白，它对mRNA的poly (A)尾巴形成起作用；FLD (FLOWERING LOCUS D, a homo log of the humanlysine-specif icdeme thy I as e I (LSD I))是催化组蛋白H3K4位点上去甲基化的酶。除了这些调控FLC表达的蛋白外，对FLC表达起明显调控效果的环境因素是低温处理，即春化。春化中FLC表达受抑制主要通过诱导表达FLC基因区域的非编码RNA的表达，然后由非编码RNA介导组蛋白甲基化，从而在表观遗传上抑制FLC的表达。FLC在春化中受到表观遗传学上的抑制，主要是激活型组蛋白修饰(こ酰化，H3K4me3)的消失，和抑制型组蛋白修饰(H3K9me3，H3K27me3)的増加。VIN3只在拟南芥春化过程中表达，它结合FLC的启动子和第一个内含子区域，导致在春化中，该区域的组蛋白去こ酰化(Wood et al.，2006)。组蛋白的H3K4me3去甲基化由FLD(FLOWERING LOCUS D, a homologof the human lysine-specific demethylase I(LSDI))催化的(Liu et al. , 2007) VRN2 (Gendall et al.，2001)和 LHPl (Sung et al. ,2006)分别通过调节H3K27me3和H3K9me3甲基化来维持FLC的抑制状态。非编码的RNA同样会參与到FLC在春化中的表观遗传学抑制，其中就包括FLC的反向转录本和反向转录本启动子区域的短RNA。研究发现，拟南芥植株体内存在ー种非编码的FLC反义转录本(Naturalantisence transcripts, NATS),它与FLC正义转录本的表达水平有关。拟南芥的天然反向转录本最早在2003年通过Tilling发现的。2007年通过Northern blot在FLC3’端杂交得到两条小RNA，大小分别为24nt和30nt，方向相反。2009年Nature报道了拟南芥FLC两个反向转录本的序列，该小RNA的产生位置不在反向转录本的第一个外显子内，位于反向转录本的启动子区域，同样小RNA位于FLC正向转录本Poly⑷尾巴后面,所以可以排除是Nat-siRNA(Swiezewskiet al. ,2007)。由于它位于反向转录本启动子附近,它有可能属于动物中报道的启动子区域的短RNA(PASRs)，FLC3’端的短RNA是否会介导组蛋白甲基化，有待于进一步的研究。大白菜和拟南芥同属于十字花科植物,亲缘关 系较近。大白菜(Brassicarapa)是严格需要春化才能开花的，和拟南芥相比，大白菜中FLC的表达量要高。2007年(Kim etal.，2007)报道大白菜基因组中共有3个FLC，即fcpFLCI、BrpFLC2、BrpFLC3。其中fcpFLC2位于2号染色体上，BrpFLCl位于10号染色体上，BrpFLC3位于3号染色体上。它们在春化中都会受到表观遗传上的抑制，从而起始开花基因的表达。2007年NCBI上公布了大白菜FLC，BrpFLC2的反向转录本的EST序列(EX096192)。但cDNA文库的材料来源不是春化中的大白菜，而是软腐菌侵染24小时内的大白菜叶片。
技术实现思路
为了深入了解大白菜春化作用的分子机制，我们启动了大白菜FLC正向和反向转录本的分离和功能研究。从大白菜早抽薹(早薹zaotai)和晚抽薹(晚薹wantai)基因型中，我们分别克隆了 4个FLC同源基因和ー个天然反向转录本。FLC同源基因分别被命名为 BrpFLCl (Genbank 登陆号 AYl 15678)、BrpFLC2 (Genbank 登陆号 AY205317)、BrpFLC3 (Genbank 登陆号 AYl 15677)和 BrpFLC5 (Genbank 登陆号 AYl 15675)，而ー个反向转录本被命名为BrpFLC2as (Genbank登陆号EX096192)。有趣的是，早抽薹基因型和晚抽薹基因型所有FLC同源基因和反向转录本的基因组序列完全一致，表明大白菜早抽薹和晚抽薹的性状不是由于两个基因型FLC基因的序列差别造成的。对早抽薹基因型zaotai和晚抽薹基因型wantai的幼苗分别进行低温春化处理。Northern blotting的检测结果表明，在BrpFLC基因3’端下游有150nt的短片段RNA,它在春化末期的叶片，及花和果荚中表达较高。由于它产生的位置位于反向转录本的启动子区域，所以推测其可能是类似动物中报道的promoter-associated short RNA作用于BrpFLC2as的启动子区域。这样，BrpFLC基因的3’端的短非编码RNA參与了春化中BrpFLC的表观遗传抑制。Northern杂交显示，在早抽薹和晚抽薹基因型的3’ UTR下游存在150nt短片段RNA与BrpFLC基因方向转录本有重叠区域。在花和果荚中表达较高，在未春化的叶中表达较低。随着春化的进行，表达量逐渐升高。预测该短片段RNA会像动物中promoter-associated short RNAs那样结合SUZ12,从而介导组蛋白H3K27me3的甲基化。免疫共沉淀的结果证明，低温诱导BrpFLC2的基因中间部分H3K27me3的甲基化。根据大白菜早抽薹和晚抽薹基因型春化作用的特点、BrpFLC基因3’端下游非编码的短片段RNA的表达方式及其在拟南芥转基因植株中的功能，我们提出了 BrpFLC2的3’端非编码RNA通过介导大白菜春化作用来调节大白菜开花时间。我们的研究结果对于遗传上改良大白菜开花时间和产品器官的形成提供可靠地理论依据。因此，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何玉科，张绍峰，孙传宝，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：