防御素及其在制备抗菌药物中的应用制造技术

本发明专利技术利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对革兰氏阴性菌和阳性菌等具有很强的抑制或杀灭作用，也可杀灭耐药菌。本发明专利技术的结果可应用于制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物，也可用于制备抗耐药的超级细菌的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及防御素及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。具体地， 涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。
技术介绍
防御素的结构特点及分类防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。 防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点(I)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加利福尼亚大学 Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类α防御素、β防御素和Θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6 个保守的半胱氨酸形成了 3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5 ； β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素一由18个氨基酸残基组成的环状Θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即ΗΝΡ1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β -防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β_防御素基因。防御素的表达与病源微生物的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。到目前为止,分离到的兔防御素有9个,其中7个为α防御素ΝΡ_1,ΝΡ-2,NP_3a, NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素:RK_1和RK-2， 来自于兔肾细胞。α-防御素NP-I比人防御素HNP-I的抗菌活性强5 10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质在NP-I分子中含有9个净正电荷，而在HNP-I 分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1, NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-I由33个氨基酸组成,属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为l-6，2-4，3-5(Ganz， 1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。防御素抗微生物机理在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-I形成瞬时的，人防御素 HNP-I形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。 正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。不同防御素的抗微生物活性由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差别。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100 μ g/ml之间(Patterson Delafied et al., 1980,1981 ；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989 ;Selsted et al.，1984，1985c， 1987，1992 ;Ganz，1985a ;Segal et al.，1985 ;Daher et al. , 1986 ；Levitz et al.，1986 ; Shafer et al. ，1988 ;Eisenhauer et al. ，1989 ;Yamashita and Saito，1989 ;Cullor et al.，1990，1991 ;Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b ;Borenstein et al·，1991a， 1991b ；Kohashi et al.，1992 ;0gata et al.，1992 ;Nakashima，1993)。与其它抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素ΝΡ-1，ΝΡ-2，不但抗性谱广，抑菌活性也较强。1984年，Selsted等发现从兔中性粒细胞分离获得的NP-I在浓度为50 μ g/ml时对3个家系的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎链球菌(Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)， 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetella bronchiseptica)抑制生长或者杀灭作用(Selsted et al. 1984) ο1985年，Lehrer等首次发现兔MCP-I和MCP_2(现名分别为，兔防御素NP-I和 NP-2)在体外对I型单纯疱疫病毒(herpes simplex virus typel，HSV-1)具有中和活性作用，而4个结构同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5对HSV-I无效。兔防御素NP-I和 NP-2对单纯疱疹病毒的灭活作用依赖于肽浓度以及肽与HSV-I孵育的时间，温度和pH。2 型单纯疱疫病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，流感病毒 A/WSN(inf luenza virus A/WSN)也易被 MCP-1 和 MCP-2 直接中和，但MC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，陈宇红，尹维波，白丽莉，孙勇如，宋丽英，赵世民，陈凡，储成才，孙永华，杨鹤鸣，张建中，彭宜红，张英涛，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：