本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，具体涉及两个猪脂肪组织特异性嵌合启动子的克隆、功能验证及应用。本发明专利技术验证了adi-pro调控元件的活性，通过嵌合的方法构建了含有pCMVIE启动子和SV40增强子的不同嵌合启动子，使adi-pro调控元件的活性大大提高，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。所述的启动子的核苷酸序列分别如序列表SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所述。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物基因工程
具体涉及一个猪脂肪组织特异启动子的构建，功能验证及应用，并通过组建嵌合启动子的方法提高其转录活性，构建成两个嵌合启动子，但同时又不破坏它的脂肪组织特异性。
技术介绍
启动子(promoter)是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(deoxyribonuclein acid, DNA)序列。启动子能够被核糖核酸 (ribonuclein acid,RNA)聚合酶,转录调节因子等识别并与之结合形成转录起始复合物区域，从而起始基因转录。启动子通常位于基因上游，它控制基因转录的起始位点和表达的程度，是RNA聚合酶进行精确有效转录所必需的。与RNA聚合酶亲和力高的启动子，其起始频率和效率均高，也称为强启动子。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别依赖于DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。 在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件(ciselement)，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。对于外源基因能否在哺乳动物细胞中高水平表达，启动子则是一个非常关键的因素。在转基因动物研究中如何选配设计启动子是决定外源基因在受体细胞中能否正确表达的关键环节，一般对非特异性表达基因而言，只能用组成型或广谱型与之重组，而对特异性表达基因而言，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性，如组织细胞特异性启动子、生长发育时期特异性启动子和诱导特异性启动子等。有时为了增强基因的特异性表达， 还必须设计出单一型增强子或复合型增强子与之匹配。有许多报道表明，采用增加启动子数目能提高外源基因的表达效率。章倩倩等学者将骨骼肌中特异高效表达的启动子序列和巨细胞病毒(CMV)启动子组合在一起大大地提高外源基因在肌肉组织的表达效率。同时增强子作为远端调控区也可增强启动子的转录活性，其中最先被研究描述的是SV40。动物和人类病毒基因转录调控机制与高等真核细胞的基因转录调控机制类同，研究病毒的启动子为了解真核生物基因组调控提供了模型，应用病毒的启动子等基因转录调节原理构建各类基因工程载体，能够有效提高目的基因的转录以及表达效率。人的CMV早期基因增强子与其它病毒增强子如疱疹病毒，劳氏肉瘤病毒和肝炎B 病毒相比是活性最高的一个增强子。在许多研究试验中通常将CMV增强子与启动子组合从而达到增强基因的转录活性^4’5’6’7’8’9’1'最新研究报道从猪BAC库中分离得到 adiponectin基因5’侧翼区序列，经过5’ -RACE确定3个转录起始位点。在该试验中通过构建一系列缺失片段，发现启动子区-1671-+263是猪adiponectin基因转录活性的有效区，其中-1671—1455是促使adiponectin基因高表达所必需的。荧光素酶报告载体和EMSA 分析在-1150—1130区存在一个重要的顺式作用元件cAMP-responsive element (CRE)，与cAMP-responsive element binding protein (CREB)结合，结果表明 CREB是猪adiponectin 基因转录活性的重要调控因子。但该片断是否可作为脂肪组织特异的高效表达启动子并不是很清楚。在转基因动物的制备过程中，需要能在特异组织中高效表达的启动子，而可用的启动子又很少。因此本研究在于选取猪的猪adiponectin基因的-1671-+263区域，将其与 CMV增强子和SV40增强子分别嵌合，从而改造成适合转基因生产所需要的启动子。为后续的转基因动物对脂肪组织特异启动子的需求提供素材。
技术实现思路
本专利技术的目的在于确定猪脂肪组织特异性调控元件adi-ρ 并验证其活性，之后通过组建嵌合启动子的方法，最终构建保留其组织特异，且能具有高效转录活性的嵌合启动子。在本专利技术中，申请人扩增了猪adiponectin基因第一外显子之前启动子区域中含有 CRE结合位点的640bp片段，将其命名为adi-ρ ，构建pGL3-Basic双荧光素酶报告载体， 与pRL-TK质粒瞬时共转染分化7天后小鼠前体脂肪细胞3T3-L1和小鼠骨骼肌细胞C2C12， 验证其活性。之后扩增了 pCMV IE启动子片段(其序列见序列表SEQ ID NO :2，片段长度为548bp)和SV40增强子片段(其序列见序列表SEQ ID NO :3，片段长度为237bp)，分别与adi-pro调控元件进行组合,构建pGL3-CMV_adi-pro启动子(见序列表SEQ ID NO -A, 长度为1188bp)和pGL3-SVenh-adi-pro (见序列表SEQ ID NO :5，长度为877bp)嵌合启动子，将这两个启动子片断分别与pRL-ΤΚ质粒瞬时共转染未分化以及分化7天的3T3-L1和 C2C12，最终得到两个活性较高的脂肪组织特异性嵌合启动子(其序列如SEQ ID NO :4和5 所示)。本专利技术是这样实现的由图I的技术流程，首先利用PCR方法扩增出adi-pro片段(电泳结果如附图2 所示)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列长度为640bp，测序后利用美国国家生物技术信息中心NCBI (http://blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. crD进行序列比对,确定所扩增的序列是正确的。接下来，扩增带有Kpn I与Mlu I酶切位点的adi-pro片段,并将这条序列克隆到PMD-18T载体上(图22)。随后用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切 pMD-18T-adi-pro载体(双酶切电泳图如图3所示)与pGL3_Basic载体(图23所示)。将从pMD-18T-adi-pro载体中酶切出的adi-pro片段与pGL3_Basic载体进行连接反应。将构建好的双荧光素酶报告载体命名为pGL3-adi-pix)，用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切该载体电泳检测adi-pro片段是否成功构建于该载体(双酶切电泳结果如图4所示)。 之后将pGL3-adi-pro与pRL_TK(图26所示)瞬时共转染分化7天的小鼠前体脂肪细胞和小鼠骨骼肌成肌细胞(图5所示)，通过酶标仪测定荧光值，用荧光比值确定adi-pro调控元件是否在成熟的脂肪细胞中表现出的活性要高于在肌细胞中表现出的活性。同时将已构建好的pGL3-adi-pix)双荧光素酶报告载体与pRL-ΤΚ瞬时共转染未分化与分化7天的小鼠前体脂肪细胞，观测adi-pro调控元件活性的变化情况。试验结果表明,adi-pro调控元件在成熟的脂肪细胞中表现出的活性要高于在肌细胞中表现出的活性(图6所示)；同时 adi-pro调控元件在未分化的脂肪细胞中活性较低，而在成熟的脂肪细胞中则表现出较高的活性(图7所示)。第二步，以真核表达载体pIRES2-EGFP (图25所示)为模板扩增带有Kpn I与MluI酶切位点的PCMVIE启动子片段(电泳本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋思文，李芳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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