本发明专利技术公开了一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及应用；其方法是从嗜盐隐杆藻克隆出甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因(ApDMT2)，用高等植物偏爱的密码子取代ApGSMT2和ApDMT2中在高等植物中出现机率较低的密码子产生基因ApGSMT2d和ApDMT2d基因，采用蛋白质定位导肽序列与甲基转移酶基因融合的方法构建出编码产物分别定位于线粒体的系列基因。ApGSMT2以甘氨酸、肌氨酸为底物催化甘氨酸甲基化，ApDMT催化二甲基甘氨酸的甲基化，二者协同催化甘氨酸甜菜碱的合成。将ApGSMT2/ApDMT2或它们的修饰基因协同转入玉米、小麦、棉花、大豆和烟草等作物，细胞积累了高浓度的甘氨酸甜菜碱，显著提高植株的抗逆性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种蓝细菌甘氨酸甜菜碱合成途径中的两种甲基转移酶基因序列以及其修饰基因的序列和它们分别编码的蛋白质序列，并将这两种基因用于作物抗逆育种， 属于基因工程领域。具体地说涉及到克隆和修饰参与一条甘氨酸甜菜碱生物合成途径中的甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因及利用。
技术介绍
在甜菜碱天然合成植物中，甘氨酸甜菜碱作为一种渗透保护物质，能够提高植物对多种非生物胁迫(如盐碱、干旱、低温等)的抗性，而且对某一胁迫的抗性程度与甜菜碱的积累水平密切相关。基因工程研究表明，通过转基因技术在植物中积累甘氨酸甜菜碱能够提高其抗逆性。在自然界中，已知的甘氨酸甜菜碱的生物合成途径主要有两种，即胆碱氧化途径和甘氨酸甲基化途径。胆碱氧化途径以胆碱为底物，通过一步或两步氧化反应合成甘氨酸甜菜碱。此途径分布广泛，由存在于微生物、植物和哺乳动物中的胆碱脱氢酶(CDH)和甜菜碱醛脱氢酶催化。存在于微生物中的胆碱氧化酶，能催化合成甜菜碱的两个连续的反应。在合成甘氨酸甜菜碱的高等植物中胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶依次催化甘氨酸甜菜碱合成。已有多个参与胆碱氧化合成甘氨酸甜菜碱的酶基因被相继克隆。甘氨酸甲基化途径是甘氨酸经过连续三步N-甲基化生成甜菜碱，是由依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(glycine sarcosine methyl transferase, GSMT)和依赖SAM的肌氛酸二甲基甘氛酸甲基转移酶(sarcosine dimethyl glycine methyltransferase, SDMT)分别催化完成的。从上个世纪80年代后期开始，陆续在一些古细菌、真细菌和极端兰细菌中发现了该条途径，但了解极少，至今只从少数几个物种中克隆得到相关基因。以胆碱为底物的合成途径已在多种生物中进行了研究。该途径中根据胆碱氧化方式的不同涉及一种或两种酶。在高等植物中，甜菜碱生物合成途径的研究主要集中于藜科植物，在苋科和禾本科植物中也有研究(McNeil et al. ,1999, 2001) 在藜科和苋科植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，先由胆碱单加氧酶(CMO)催化生成甜菜碱醛，后者在甜菜碱醒脱氢酶(BADH)催化下生成甜菜碱(Weretilnyk et al. , 1989 ；Akamoto, 2000) 目前，CMO仅在藜科和苋科植物中发现，推测其它科植物可能具有不同的胆碱氧化酶。而编码BADH的基因已经从菠菜(Weretilnyk and Hanson, 1990)等多种植物中克隆。BADH并不是甘氨酸甜菜碱合成特用的酶，它与ω-氨基醛脱氢酶(一种在多胺代谢中广泛存在的3酶)相同(Holmstrom et al. , 1994 ；Rathinasabapathi et al. , 1994)。在大肠杆菌中，与甜菜碱合成相关基因由bet操纵子编码(Andresen et al., 1988 ；Lamark et al. , 1991) :betA 编码 CDH, betB 编码 BADH, betT 编码胆喊转运蛋白，betl 编码调控蛋白，从胆碱到甜菜碱的转变途径与植物中类似，是由两种酶催化的，即胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase, Q)H)和BADH。Q)H是一种依赖氧的膜结合黄素蛋白，不但能催化胆碱氧化为甜菜碱醛，而且能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛的氧化。BADH是一种依赖于NAD的可溶性蛋白，对甜菜碱醒具有很高的亲合性(Landfald and Strom, 1986)。在微生物球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)和滋养节杆菌(A. pascens) 中，甘氨酸甜菜碱的合成仅需要一种酶即胆碱氧化酶(choline oxidase, COD)催化(Ikuta et al.，1977)，同时产生 H2O2。以甘氨酸为底物合成甜菜碱的途径首先是在两种极嗜盐的微生物 Actinopolyspora halophila和Ectothiorhodospira halochloris 中发现的(Nyyssola et al. ,2000,2001 ；ffaditee et al. ,2003) 在这些微生物中，甘氨酸经过连续三步N-甲基化生成甘氨酸甜菜碱，反应的第一步是由依赖S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(glycine sarcosine methyltransferase, GSMT)催化的，反应的第二步由GSMT或依赖SAM的肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶(sarcosine dimethylglycine methyltransferase, SDMT)催化，最后一步是由 SDMT 催化的(Nyyssola et al. , 2001 ；ffaditee et al. ,2003)。甜菜碱生物合成的基因工程研究对天然积累甜菜碱生物体的生化分析表明，甜菜碱在植物体内是稳定的，并且甜菜碱积累的限速步骤是其合成而不是其降解(Rhodes and Hanson, 1993)。随着人们对植物和微生物中甜菜碱生物合成途径分子机制深入了解，大量甜菜碱合成的相关基因也相继被克隆。这为通过基因工程的手段在不积累甜菜碱的生物体内建立甜菜碱生物合成途径提供了分子依据。目前参与甜菜碱合成的多个基因如COD、CDH、CM0、BADH等已在多种植物中转化成功，这些转基因植株积累了不同水平的甜菜碱，提高了其对多种逆境的抗性。高等植物中，胆碱转化为甜菜碱由胆碱单氧化酶(CMO)催化，已先后从菠菜 (Rathinasabapathi et al·, 1997)、甜菜(Russell et al. , 1998)和山菠菜(Atriplex hortensis)(沈义国等，2001)中克隆到CMO并进行了转基因研究，这些基因具备信号肽序列，用于引导成熟肽链定位于叶绿体基质。Nuccio等(1998)将菠菜的CMO基因转入烟草，转基因产物定位于叶绿体中，然而CMO活性和甜菜碱含量都非常低(彡50nmol g—1 FW) (Nuccio et al. ,2000)。然而，当CMO在细胞质中表达,而不是在叶绿体中表达时,转基因烟草中甜菜碱含量大大提高(430nmol g-1 FW)。McNeil等(2000)用14C标记的胆碱(甜菜碱合成底物)追踪研究转基因烟草中胆碱代谢的动力学，发现胆碱由胞质向叶绿体的转运是制约叶绿体内甜菜碱合成的主要因素(McNeil et al.，2000)。磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶(PEAMT)是胆碱合成途径中的关键酶，它催化磷酸乙醇胺生成磷酸胆碱的甲基化反应。McNeil等(2001)将菠菜的PEAMT和CMO基因以及甜菜的BADH基因共转化到烟草叶绿体，同单转CMO基因烟草相比，转多基因烟草的游离胆碱含量提高了 50倍，甜菜碱含量提高 7 30 倍，最高达至 Ij I. 8 μ mo I g_1 Fff (McNeil et al. ,2001) 自1981年从高等植物中分离到BADH后，有关甜菜碱合成酶的研究很快引起了广泛关注。已从疲菜(Wer本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张举仁，何影，李坤朋，何春梅，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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