一种高收率人凝血酶原复合物的制备方法，包括化浆、调整蛋白浓度和pH值、凝胶吸附、洗涤、洗脱、稀释调整蛋白浓度和离子强度、S/D病毒灭活、再凝胶吸附、再洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活工艺步骤，除菌分装时，检测浓缩液效价，依据检测结果先加入0.5-1.5%的甘氨酸和0.5-1.5%盐酸精氨酸，再以Ⅸ因子总效价的0.2-0.3倍加入肝素钠作为成品保护剂，然后进行配制、除菌分装。本发明专利技术与现有技术相比，具有工艺简单、安全性高、产品收率高、比活高等特点，产品收率达到45.28±2.26万IU(以IX因子效价计算)/吨血浆，比活达到0.87±0.12IU/mg。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域药物制备方法，特别是ー种。
技术介绍
对こ型血友病和因肝脏疾患引起的凝血功能异常，目前主要采用高纯度人凝血因子IX，或是主要含有维生素K依赖的凝血因子II、vn、ix、X的凝血因子复合物(凝血酶原复合物)血浆蛋白制剂。输注人凝血酶原复合物能提高血液中凝血因子II、vn、ix、X的浓度， 主要用于治疗先天性和获得性凝血因子II、vn、ix、X缺乏症。现有的人凝血酶原复合物的生产方法，均采用去除冷沉淀的上清新鲜血浆或F III 沉淀为原料，包括以下エ序DEAE sephadex A_50凝胶吸附、洗涤、洗脱、超滤、S/D病毒灭活、凝胶吸附、洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活。如华兰生物公开的《冻干人凝血酶原复合物的生产方法》(公开号CN 1475569A)，江西博雅公开的《ー种人凝血酶原复合物的制备エ艺》(公开号CN 101974070A)，山东泰邦公开的《提高人凝血酶原复合物稳定性 F VII得率的エ艺方法》。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，而提供ー种エ艺简单、安全性高、产品收率高、比活高的。本专利技术的技术方案是ー种，包括化浆、调整蛋白浓度和pH值、凝胶吸附、洗涤、洗脱、稀释调整蛋白浓度和离子强度、S/D病毒灭活、再凝胶吸附、再洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活エ艺步骤，除菌分装时，检测浓缩液效价， 依据检测结果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%盐酸精氨酸，再加入肝素钠。本专利技术进一歩的技术方案是调整蛋白浓度和pH值时，将去除冷沉淀、澄清过滤的血浆用2-8°C 0. 9%生理盐水调整蛋白浓度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸钠缓冲液调pH 值至 6. 8-7.2。稀释调整蛋白浓度和离子强度后，再加入0. 5-1. 5%的甘氨酸保护剂。洗涤、洗脱时，洗涤液中氯化钠浓度为0. 10-0. 15mol/L,枸橼酸钠浓度为0.01-0. 02 mol/L, pH值为6. 8-7. 2 ;洗脱液中氯化钠浓度为I. 5-2. Omol/L,枸櫞酸钠浓度为 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值为 6. 8-7. 2。再洗涤、洗脱时，洗涤液中氯化钠浓度为0. 02-0. 05mol/L,枸櫞酸钠浓度为0.01-0. 02 mol/L, pH值为6. 8-7. 2 ;洗脱液中氯化钠浓度为I. 5-2. Omol/L，枸櫞酸钠浓度为 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值为 6. 8-7. 2。本专利技术与现有技术相比，具有エ艺简单、安全性高、产品收率高、比活高等特点，产品收率达到45. 28±2. 26万IU (以IX因子效价计算)/吨血浆，比活达到0. 87±0. 12IU/ mg 本专利技术在DEAE sephadex A_50凝胶吸附前，用2_8°C 0. 9%的生理盐水调整蛋白浓度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH值至6. 8-7. 2，利用血浆中各组分蛋白等电点的差异，使凝血酶原II、VII、IX、X因子充分被DEAE sephadex A_50凝胶吸附，而其他蛋白尽可能不吸附或少吸附。试验结果表明，本专利技术与现有エ艺比较，以IX因子为例，产品得率提高 15-20%,比活由原来的 0. 62 ±0. 26IU/mg 提高至Ij 0. 87 ±0. 12IU/mg。本专利技术在洗涤、洗脱时，先用氯化钠浓度为0.050-0.075mol/L，枸櫞酸钠浓度为 0. 01-0. 02 mol/L, pH值为6. 8-7. 2的洗涤液洗涤，再用氯化钠浓度为I. 5-2. Omol/L,枸橼酸钠浓度为0. 01-0. 02 mol/L，pH值为6. 8-7. 2的洗脱液洗脱，通过控制洗涤液和洗脱液的氯化钠、枸櫞酸钠浓度以及PH值，达到既能有效去除杂蛋白，又能尽可能多的保留有效成分II、vn、ix、X因子的活性，明显提高这类相关因子的回收率。以IX因子为例，试验结果表明，本专利技术此步操作回收率可以达到91. 87%±2. 56%，经进ー步处理后，所得制品的总回收率达到72%以上，比现有エ艺提高了 15-20%。本专利技术在S/D病毒灭活前，先将洗脱液用0. 45-1. Oum的滤芯过滤除去细小颗粒， 然后用0-8°C注射用水将洗脱液稀释至蛋白浓度为0. 5-2. 5%，离子强度为5-15mS/cm，加入0.5-1. 5%的甘氨酸保护剂，最后加入S/D溶液，由于降低了蛋白浓度，加入了蛋白保护剂， 既保证了 s/d病毒灭活效果，在操作过程中又能使有效成分II、vn、ix、X因子的活性损失更少。本专利技术在S/D病毒灭活后，先使用氯化钠浓度为0. 02-0. 05mol/L,枸橼酸钠浓度为0.01-0. 02 mol/L, pH值为6. 8-7. 2的洗涤液洗涤7_10次，再用氯化钠浓度为1.5-2. Omol/L,枸櫞酸钠浓度为0. 01-0. 02 mol/L, pH值为6. 8-7. 2的洗脱液洗脱2-3次， 通过分别控制再洗涤、洗脱时洗涤液和洗脱液的氯化钠浓度、枸櫞酸钠浓度、PH值，以及洗涤次数、洗脱次数，达到既能有效去除S/D残留，同时又能尽可能多的保留有效成分II、vn、 IX、X因子。以IX因子为例，试验结果表明本专利技术此步操作比现有エ艺的回收率高3%左右。本专利技术在除菌分装前加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%盐酸精氨酸，以IX因子总效价的0. 2-0. 3倍加入肝素钠作为成品保护剂。由于冻干和干热灭活对制品效价有较大影响，本专利技术采用双氨基酸作为成品保护剂，既能保证产品能有效的进行病毒灭活，又有效的保留了有效成分n、vn、ix、x因子的活性。与单ー氨基酸保护剂比较，比活由原来的 0. 62±0. 26IU/mg 提高到 0. 87±0. 12IU/mg。以下结合具体实施方式对本专利技术的详细内容作进ー步描述。具体实施方式基本要求1、原料血浆的采集和质量应符合《中国药典》血液制品生产用人血浆的要求；2、生产设备管线器具应清洁消毒；3、生产过程应符合血液制品生产规范要求。实施例一ー种，包括如下エ艺步骤(I)化浆以符合药典要求的低温冰冻血浆为原料，用酒精消毒血浆袋表面后，用注射用水化浆，混浆温度0-4°C，再离心去除冷沉淀，澄清过滤；(2)调整蛋白浓度和pH值将上述去除冷沉淀、澄清过滤的血浆调整蛋白浓度至3.0%， 然后用醋酸-醋酸钠缓冲液调PH值至6. 8-7. 2 ；(3)凝胶吸附按I.0-1. 5kg干胶/IOOOkg血浆量加入用平衡液处理后DEAE sephadex A-50凝胶，搅拌吸附45-60分钟，收集凝胶，上清液并入血浆罐中，平衡液中氯化钠浓度为 0. 050-0. 075mol/L,枸櫞酸钠浓度为 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值为 6. 8-7. 2 ；(4)洗涤、洗脱先用洗涤液洗涤凝胶2-3次，再用洗脱液洗脱凝胶2-3次，收集洗脱液；(5)稀释调整蛋白浓度和离子强度将上述洗脱液用0.45-1. Oum的滤芯过滤除去细小颗粒，然后用0-8°C注射用水将洗脱液稀释至蛋白浓度为0. 5-2. 5%，离子强度为5-15ms/ cm ；(6)S/D病毒灭活在洗脱液中加入S/D本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种人凝血酶原复合物的制备方法，包括化浆、调整蛋白浓度和PH值、凝胶吸附、洗涤、洗脱、稀释调整蛋白浓度和离子强度、S/D病毒灭活、再凝胶吸附、再洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活エ艺步骤，其特征是除菌分装时，检测浓缩液效价，依据检测结果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和·0. 5-1. 5%盐酸精氨酸，再以IX因子总效价的0. 2-0. 3倍加入肝素钠作为成品保护剂，然后进行配制、除菌分装。2.根据权利要求I所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征是调整蛋白浓度和pH 值时，将去除冷沉淀、澄清过滤的血浆用2-8°C 0. 9%生理盐水调整蛋白浓度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸钠缓冲液调PH值至6. 8-7. 2。3.根据权利要求I或2所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征是稀释调整蛋白浓度和离子强度后，再加入0. 5-1. 5%的甘氨酸保护剂。4.根据权利要求I或2所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征是洗涤、洗脱时，洗涤液中氯化钠浓度为0. 10-0. 15mol/L，枸櫞酸钠浓度为0. 01-·0. 02 mol/L, pH值为 6. 8-7. 2 ;洗脱液中氯化钠浓度为I. 5-2. OmoI/L,枸櫞酸钠浓度为0. 01-0. 02 mol/L, pH值为 6. 8-7. 2。5.根据权利要求3所述的人凝血酶原复合物的制备方法，其特征是洗涤、洗脱吋， 洗涤液中氯化钠浓度为0. 10-0. 15mol/L,枸櫞酸钠浓度为0.01-·0.02 mol/L, pH值为 6. 8-7. 2 ;洗脱液中氯化钠浓度为I. 5-2. Omol/L，枸櫞酸钠浓度为0. 01-0. 02 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：岳跃飞，单永红，资道凤，黄忠文，
申请(专利权)人：湖南紫光古汉南岳制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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