本发明专利技术涉及非接触式电导法实现PCR过程的实时检测系统和方法，其特征在于所述系统包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度传感电路、加热电路、数模/模数转换接口DAQ及上位的Labview控制中心；所述的集成PCR微芯片集成了微反应腔、温度传感电极和加热电极以及电化学检测电极，硅基底正面刻蚀微反应腔，背面集成加热电极和温度传感电极；电化学检测电极为叉指电极，通过绝缘层与硅基底键合，与微反应腔形成密闭结构，通过控制硅基底背面的温度传感电极和加热电极实现扩增反应所需的温度循环。本发明专利技术所述的检测系统的灵敏度和分辨率可达fg/μL以下，电极复用性高，使用寿命长、检测结果可靠性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非接触式电导法实现聚合酶链反应(PCR)过程的实时检测系统和方法，包括聚合酶链反应(PCR)微芯片、非接触式电导电化学检测电极、高灵敏度读出电路和分析方法等，属电化学传感
技术介绍
致病微生物的快速检测和分析是食品安全、环境监测、公共卫生等领域迫切需求的技术，实时荧光定量PCR技术为微生物的检测分析提供了有效的工具，该技术的主要优点是在核酸的扩增过程中对核酸进行定量分析，从而缩短了常规终点检测法所需要的时间。然而，目前所有的实时定量PCR均是基于光学检测方法，需要进行荧光标记同时需要复杂和昂贵的光学检测系统进行荧光检测，仪器构造复杂，难以小型化，只适合在中心实验室进行，因此目前尚缺乏适合于现场微生物快速测定的手段和仪器。电化学检测方法的原理是以脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的扩增产物为敏感对象，电化学电极为信号转换器，以电势、电流或电导等为特征检测信号，实现实时检测PCR反应过程。检测的依据在于1)DNA的一些组分在一定电势窗口下有电化学活性的 (例如鸟嘌呤)，可直接在电极表面实现电子转移；2)通过外部的一些氧化还原媒介(如亚甲基蓝、Hoechst 33258、道诺霉素和棘霉素等)来实现电子传递，借助于这些与DNA选择性结合的有电化学活性的指示剂来进行杂交检测。以纳米金颗粒做标记物不仅有更好的生物相容性，它的表面可以催化银颗粒的沉积，增加了信噪比。近年来的电化学检测法已经达到了较高的灵敏度，如灵敏度达ng/uL级或用ssDNA探针标记杂交甚至可以达到单分子检测水平。相比较于荧光法的背景光干扰多，电化学法的背景噪声较小，检测效率较高。如上所述，电化学检测具有灵敏度高、成本低、易于集成化、微型化等优点，若能将电化学检测方法与先进的微机械加工技术相匹配，具有实现大规模生产的潜力，因此采用电化学方法对PCR 过程进行实时检测，不仅能得到可与荧光定量PCR媲美的检测结果，且电化学检测所需的设备简单，操作方便，可在条件简陋的场合应用且不需要专业人员操作。虽然片上的DNA扩增分析的电化学技术已经较成熟，目前文献报道的电化学检测实时PCR过程均采用接触式电极直接测定，不管是用非标记法还是标记法，基于的原理都是检测终产物在电极表面富集或引起电极表面离子浓度变化而引起电流或电阻抗的变化。 因此电极表面会有残留物，它的二次检测远达不到第一次检测时的性能。虽然可以在二次检测前对电极进行清洗处理，但是这样的过程就复杂化了，且效果不能十分明显。若使用一次性电极，则增加了检测的成本和资源的浪费。接触法检测的优点是分辨率较高，但是表面吸附易饱和，检测范围受限，易污染，复用性不高，使用寿命短。且电极加压后对溶液中分子有电离水解作用，不利于敏感检测。在使用标记法的过程中，标记物与目标DNA杂交，其空间结构都发生了变化，发生空间阻碍效应，从而影响结合效率
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非接触式电导法实现PCR反应过程的实时检测系统和方法，本专利技术的特征是用非传统的非接触式电导检测方法(capacitively-coupled, contactless conductivity detection, C4D)代替传统的接触式电化学方法,实现集成芯片上的PCR过程的实时检测系统。非接触式方法因为电极不与电解液直接接触，大大小减小了背景噪声，可以达到更小的检测限。另外也无直接接触导致的电极表面产生气泡的问题。易集成，且电极和溶液都不易被污染，电极的复用性很高。目前文献报道应用于电泳芯片的非接触式电极系统可达的检测限在5X 10_8和1X10_7M之间。本专利技术是将非接触式概念引入到集成的PCR扩增及检测芯片中，不仅大大简化了 PCR扩增的体系(无需标记物和探针)，而且又提高了电极的使用寿命，由此减少了设备的成本。而且系统所需的设备都十分简单，易集成，可在条件简陋的现场使用及便携式应用。本专利技术的目的是通过以下措施来达到基于微机电系统(MEMS)技术设计制造PCR 微芯片，并集成非接触式电导检测器，设计制作微米级甚至纳米级介电绝缘层，显著提高电导检测器的灵敏度；PCR微芯片同时集成温度传感电极和加热电极，基于差分信号放大原理和温度补偿原理，显著提高读出电路的分辨率和抗干扰能力；工作电极采用的是叉指电极结构，每根电极均作为工作电极，因此它感应的总体信号要远大于单电极，具有更高的检测灵敏度和分辨率；本专利技术采用实际样本进行分析和验证所建立PCR反应过程的非接触式电导检测方法。本专利技术提供了一种有效的检测实时核酸扩增过程的电化学检测方法，通过该方法可以检测待测核酸的初始浓度，且能在PC机上实时监测核酸扩增过程。用厚度为100 μ m 的盖玻片作绝缘层做初步的实验，在以纯化的DNA水溶液为检测对象的实验中，只需10 μ L 的样品体积，可达到O. Ipg/μ L的检测下限和O. 5pg/yL的分辨率，且可区分单链或双链 DNA (单链DNA的阻抗比双链DNA大，同浓度双链DNA产生的电压差大于单链DNA)。随着绝缘层厚度的减小和材料的优化(纳米级厚的氮化硅或二氧化硅)，该非接触式检测系统的灵敏度和分辨率预计可被改善到fg/ U L级以下。相应地，fg/ μ L级水平的模板初始浓度的PCR反应预计在温度循环5min以内即可定性检测到明显的扩增产物增加引起的电压变化，非常快速有效。用已知的不同初始浓度的模板进行一系列的PCR扩增反应，记录相同循环数内产生的电压差变化，制定标准曲线，即可作为定量PCR的依据。实现该方法的系统易控制，操作简便，易集成，体积小，功耗小，成本低，检测电极使用寿命长。实现该方法的集成系统因为体积小，可将多个反应腔和控制系统做在同一个装置上，实现高通量并行检测多个样本，且易便携化，可在现场应用，有非常广的应用范围。所述实时检测系统包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度传感电路、加热电路、数模/模数转换接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激励电源连接PCR微芯片中的电化学检测电极；加热控制电路连接PCR微芯片中的加热电极；电化学检测电极另一端则与电流转电压及放大电路连接；温度传感电路连接PCR微芯片中的温度传感电极；温度传感电路、电流转电压放大电路又与模数/数模转换接口 DAQ连接，模数/数模转换接口 DAQ分别与上位机的Labview控制中心及加热控制电路连接，所述的集成PCR微芯片集成了微反应腔、温度传感电极和加热电极以及电化学检测电极，硅基底正面刻蚀微反应腔，背面集成加热电极和温度传感电极；电化学检测电极为叉指电极，通过绝缘层与硅基底键合，与微反应腔形成密闭结构，通过控制硅基底背面的温度传感器电极和解热电极实现扩增反应所需的温度循环。本专利技术提供的非接触式电导检测实时核酸扩增过程的方法与传统的核酸扩增电化学检测法具有以下特点I、本专利技术采用非接触式电导检测，避免了检测电极和待测对象之间的相互污染， 无需电极清洗重生等复杂步骤，操作简便，电极复用性高，使用寿命长，且检测结果可靠性闻。2、本专利技术电化学检测电极采用叉指电极作为工作电极，检测效率远远大于普通的单工作电极。叉指电极的工作性能由叉指长度、叉指间距、叉指数、有效工作面积等多种参数决定本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金庆辉，方新心，景奉香，张洹千，赵建龙，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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