拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT87A2的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明专利技术利用基因UGT87A2构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐旱性得到显著提高，预示本发明专利技术实施后将会创造新型耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一个糖基转移酶基因及其应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT87A2在提高植物耐旱性中的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles, 2004; Bowles et al. , 2006; Wang and Hou, 2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou, 2009)。生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同的家族。其中家族I包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族I中大多数基因C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒(plant secondary product glycosy I transferase box)。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成， 通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中大部分的功能还不清楚。见7 7尤 是拟南芥糖基转移酶家族I中的一个成员，目前它的基因序列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索，拟南芥糖基转移酶基因见7 7尤 在增强植物耐旱性中的应用目前未见报道。
技术实现思路
(I)本专利技术的目的针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的应用。(2)实现本专利技术的具体技术方案本专利技术所述拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2在提高植物耐旱性中的应用。其中所述糖基转移酶基因UGT87A2的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。本专利技术利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT87A2，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到显著提高。(3)本专利技术实施后带来的有益效果实验证实，应用本专利技术所述拟南芥糖基转移酶基因见货7尤 进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的耐旱性(见附图I、附图2和附图3)。预示本专利技术实施后将会创造新型耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。附图说明图I.干旱处理实验。其中Col-O为拟南芥对照植物，叹访7a之为突变体，87A20E-1 和87A20E-2为两个过表达株系。拟南芥对照植物、突变体和过表达株系正常培养2周，然后停止浇水12天，突变体会全部出现萎蔫，野生型对照只部分出现萎蔫，而两个过表达株系均无萎蔫现象。这说明见7 7尤 基因过表达之后明显增强了植株的抗旱性。图2.干旱处理后的存活率统计。其中Col-O为拟南芥对照植物，ugt87a2为突变体，87A20E-1和87A20E-2为两个过表达株系。拟南芥对照植物、突变体和过表达株系正常培养2周，然后停止浇水12天，再恢复浇水3天，统计植株的存活率。结果两个过表达株系的存活率明显高于野生型对照及突变体。突变体 访的存活率最低。这说明过表达株系的耐旱性最强，见7 7尤 基因过表达之后明显增强了植株的抗旱性。图3.离体失水率实验。其中Col-O为拟南芥对照植物，为突变体， 87A20E-1和87A20E-2为两个过表达株系。实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物、 突变体和两个过表达株系。选取生长状态一致的植株，剪取地上部分，放于室温下的台面上，每隔20min测定植株的鲜重，计算每个时间段的离体失水率。结果2个过表达株系的离体失水率最低，说明过表达株系水分散失较慢，保水性优于野生型对照及突变体。说明了 UGT87A2基因在增强抗旱性方面的作用。具体实施例方式实施例I克隆拟南芥糖基转移酶基因I.拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2的克隆通过公开网站http://www. cazy. org获得泌基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，正向引物为87A2-F: 5’ -GCGTCTAGAATGGATCCAAATGAATCTCC-3’，反向引物为 87A2-R: 5’ -GCGGAGCTCTTAAITTGTAITGGTAATAT-3’。利用 TRIzol 试剂盒提取拟南芥 RNA， RT-PCR方法扩增见7 7尤 基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过油a I和 Sac I酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成测序中间载体，称为pK87A2,然后用载体进行基因全长PCR扩增和ZAa I和fee I酶切验证,最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。2.拟南芥糖基转移酶基因的序列信息与特性分析UGT87A2基因的编码区cDNA为1368bp，编码455个氨基酸的51. 7kDa蛋白，C端具有 44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。3.拟南芥糖基转移酶基因见7 7尤？的表达分析组织特异性表达对成熟的野生型拟南芥Col-O的各个组织器官包括根、茎、莲座叶、 茎生叶、花、角果等进行RT-PCR分析，发现UGT87A2在各个组织器官中都有表达。见货沒之启动子驱动⑶S表达为了定位见TST7A 基因表达的精细部位，将 UGT87A2启动子区域2000bp的片段构建到pBI121 (⑶S表达载体)，取代该载体上的35S启动子。通过农杆菌GV3101转化拟南芥，最后筛选获得/7见7 7尤 右动f: .-GUS纯系植株。，萌发阶段UGT87A2在根、子叶都有表达；营养生长阶段在根、老叶叶边缘有表达；生殖阶段在花托，雄蕊，幼嫩角果与果柄的连接处，成熟角果的隔膜中都有表达。实施例2拟南芥糖基转移酶基因UGT87A2的转基因应用I.含有UGT87A2编码区cDNA表达载体的构建PK87A2中间测序载体经过油a I和fee I双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全长 cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的PBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S 启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为PB87A2。2.农杆菌介导植物转化农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT87A2植物表达载体 (PB87A2)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)， 使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集 Tl代种子并在筛选培养基(MS培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选， 挑选出绿苗白苗为3:1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯丙凯，王波，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：