本发明专利技术公开了突变的成纤维细胞生长因子（FGF-21）及其在治疗内分泌疾病中的用途。本发明专利技术突变的成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示，其编码基因序列为SEQIDNO:1所示。本发明专利技术以野生型FGF-21为模板，通过下游引物引入两个精氨酸（Arg），PCR后获得突变体，主要利用Arg的强碱性以及它在生理条件下带正电荷，不仅上调FGF-21的等电点，还帮助FGF-21结合到细胞膜表面。动物学试验结果表明，本发明专利技术突变的FGF-21能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明专利技术突变体在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明专利技术突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及成纤维细胞生长因子，尤其涉及突变的成纤维细胞生长因子及其制备方法，本专利技术还涉及该突变的成纤维细胞生长因子在制备治疗内分泌疾病药物中的用途， 属于成纤维细胞生长因子领域。
技术介绍
糖尿病是继心脑血管疾病和肿瘤之后的人类第三大杀手。随着生活模式、饮食结构的改变，全世界糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年世界糖尿病患病人数将增至3. 66亿人，糖尿病将成为世界各个国家一个沉重的负担。对于2型糖尿病，绝大多数的患者不可避免的要用药物来治疗。其中，口服药物有三大类第一类为黄脲类。如优降糖，糖适平，达美康，美吡达等。黄脲类药能够刺激胰岛分泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，这对低血糖患者而言是一个不可忽视的危险因素，而且部分药物具有较大副作用，如可引起肝功能损伤。第二类药是双胍类药。如降糖灵和二甲双胍；双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛素的利用，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂，如拜糖平等；这类药的作用是减少人体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，血糖升高也比较缓慢。但该药的主要副作用就是胃肠反应，服用后如发生低血糖反应，还要口服或静脉注射葡萄糖。目前注射药物主要是胰岛素，注射用的胰岛素在糖尿病的治疗中发挥着重要的作用。但也有其不足，主要为用药后心慌、表情异常、流汗等，重者产生胰岛素休克或低血糖性惊厥；注射胰岛素的患者，经一度停药再用药时，对胰岛素的需用量愈来愈大，使患者必须每天必须多次注射胰岛素，给患者带来很大痛苦，而且大剂量用药也加大了集体产生副作用的机制，其原因可能是机体产生了胰岛素抗体，抗体与胰岛素结合而减弱其作用。近年来，随着人基因组序列的破译，一批具有独立调节血糖，有望成为新型治疗糖尿病药物的蛋白被相继发现，成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)就是其中之一。已有大量实验证明FGF-21是除胰岛素外，生物体内又一个能够独立调节代谢水平的蛋白因子。在已完成的研究中发现，FGF-21能够独立促进小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取(不论胰岛素存在与否)，并以剂量依赖性的方式降低ob / ob和db / db小鼠以及ZDF大鼠餐后及空腹时血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在发挥作用的同时，FGF-21没有引起低血糖等其它糖尿病治疗药物常见的副作用。FGF-21的发现为糖尿病患者尤其是糖尿病晚期胰岛素抵抗严重的患者带来了新的希望。但是FGF-21在人体内代谢时间较短，同胰岛素一样需要多次注射才能稳定患者血糖。因此，将FGF-21进行适当改造，在不改变其原有活性的基础上增加其稳定性及活性，这对于将FGF-21应用于临床具有非常重要的意义。在以往生物药物研究中，多采用随机突变的方法进行蛋白改造，由于突变的随机性及蛋白功能的复杂性，随机突变结果往往适得其反，浪费了大量人力和物力。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供突变的成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)及其编码基因；本专利技术的目的之二是提供一种设计该突变的成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)的理论基础；本专利技术目的之三是提供含有突变的成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)基因的表达载体或质粒以及含有该表达载体和宿主细胞；本专利技术目的之四是将该突变的成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)应用于制备成治疗糖尿病的药物或药物组合物。本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的一种突变的FGF-21，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示；编码该突变的FGF-21的核苷酸序列为SEQ ID NO: I所示。主要利用Arg的强碱性以及它在生理条件下带正电荷，不仅上调FGF-21的等电点，改善了 FGF-21的稳定性，还帮助FGF-21结合到细胞膜表面，赋予了 FGF-21在降低血糖水平方面起效快、药效好等优点。并且，本专利技术目的明确，保留了很高的同源性，节省了大量后续工作。有利于加快该蛋白的药用开发。本专利技术所述突变的FGF-21的方法，包括如下步骤以从正常人肝脏中提取的RNA 为模版，并以此为模板逆转录获得编码FGF-21的基因，以此为模板，通过下游引物引入突变，PCR后获得突变体，将所获得的突变基因连接到构建好的表达载体中；将所述表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达，活性检测。含有该突变的FGF-21核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的包括在本专利技术的保护范围之内。优选的，可以将突变的FGF-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白 (SUMO)；本专利技术还提供了一种生产突变FGF-21的方法，包括将突变的FGF-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21，分离纯化FGF-21，利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。优选的,所述的表达载体可以是pET_30a ( + ),所述的宿主细胞可以是Ti-aflsetta (DE3);所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；其中，所述的纯化包括将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐。动物学试验结果表明，本专利技术突变的FGF-21相比于野生型FGF-21，能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本专利技术突变的FGF-21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本专利技术突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。说明本专利技术中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见 ⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I FGF-21基因的克隆根据FGF-21基因去除信号肽的核苷酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。利用在线软件Primer5. 0设计FGF-21突变体引物。以提取的人肝脏总RNA为模板，Oligo (dT) 15为引物，参照M-MLV反转录酶M-MLVRT 说明书进行cDNA第一条链合成，反应体系和具体操作分别如下aigo(dT)i5 1.0 ui 模板5.0 111IXPC-H0 7.0 pi70°C水浴5min，冰上放置5min，依次加入SXasia1.0 d5X M-MLVRT buffer5 MdN'm5.0 ulM-MLYRT1.0 gl37 °C水浴2 h，70 °C水浴15 min，取2耵用于PCR扩增反应。采用常规PCR方法扩增FGF-21突变体成熟多肽cDNA，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王文飞，李德山，刘铭瑶，何坤，吴云舟，任桂萍，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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