本发明专利技术涉及一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法及其产品，属于生物医药技术领域。本发明专利技术利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入连接肽序列片段，然后利用重叠延伸PCR技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与蛋白抗原基因进行融合，然后构建融合基因的重组家蚕杆状病毒并利用家蚕生物反应器进行目的蛋白的表达。本发明专利技术采用家蚕生物反应器表达了口服免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白，不仅实现了蛋白的高效表达，而且将口服免疫佐剂与抗原蛋白融合表达作为分子内免疫佐剂增强了免疫效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，尤其涉及免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备， 属于生物医药
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)由 Barry J. Marshall 和 J. Robin Warren于1983年首次发现，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的革兰氏阴性菌， 是慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WH0/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。目前全球近50%的人口感染了幽门螺杆菌，在发展中国家其感染率可高达70%以上，严重影响了人类的健康。现有的治疗幽门螺杆菌的手段主要是联合应用抗生素及抑酸剂，但存在耐药性广泛，副反应大，治疗费用高且易复发等缺点。免疫治疗可能是有效控制幽门螺杆菌的最有效、最有前景的方法之一，幽门螺杆菌疫苗的研制已经成为目前研究的热点。目前已发现尿素酶(UreA和UreB)、空泡毒素(VacA)、热休克蛋白(HspA和HspB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)、细胞毒素相关蛋白 (CagA)、黏附素(Adhesin)等亚单位蛋白或其融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应，其中尿素酶B亚单位(UreB)由于缺乏尿素酶活性却保留了其免疫原性、在幽门螺杆菌中高度保守而被确定为幽门螺杆菌疫苗研究的首选抗原。为了增强幽门螺杆菌蛋白的免疫原性一般将其与粘膜佐剂联合应用，目前幽门螺杆菌疫苗常用免疫佐剂是霍乱毒素(Cholera toxin, CT)和大肠杆菌不耐热毒(Heat-labile enterotoxin, LT),但都具有明显肠毒性，现在多采用CT的B亚单位(CTB)以及LT的B亚单位(LTB)代替全毒素作为免疫佐剂。在口服蛋白亚单位疫苗生产中蛋白亚单位抗原的表达量成为制约其成本的关键因素，因此寻找低成本表达抗原蛋白的方法势在必行。目前家蚕生物反应器主要是利用家蚕杆状病毒表达系统实现对外源基因的表达。其优势主要有I)表达量高利用杆状病毒POlh基因和PlO基因的强启动子驱动外源基因的高效表达；2)可容纳大的外源基因杆状病毒基因组在大小上差异很大(88 165kbp)，病毒可以容纳较大的外源基因片段而不影响自身正常的复制和包装；3)适合于表达毒性蛋白由于重组杆状病毒极晚期基因启动子驱动的外源基因的表达是在子代芽殖、有感染力病毒成熟之后进行的，因此，表达具有细胞毒性的蛋白不会影响病毒的复制；4)具转录、翻译后加工家蚕杆状病毒表达系统具有很强的转录、翻译后加工能力，表达产物在结构、生物活性、免疫原性和糖基化修饰等方面与天然蛋白具有很强的相似性；5)安全性好昆虫杆状病毒只在无脊椎动物细胞中复制，对脊椎动物和植物细胞而言并非病原体，因此昆虫杆状病毒表达系统对使用者是安全无害的 (家蚕杆状病毒的表达宿主有家蚕细胞、家蚕幼虫和蚕蛹，但家蚕幼虫和蚕蛹使用范围较广，因其便于注射操作)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种重组杆状病毒BmNPV- (CTB-Linker-^rM)，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒iBombyx mori nucleopolyhedrovirus')，媒氣编CGMCC No. 5580。上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker- r￡沿)的制备方法，包括以下步骤(1)由PCR扩增的方法获得口服免疫佐剂CTB基因序列与幽门螺杆菌抗原蛋白《rM 基因序列，并且在口服免疫佐剂CTB基因与抗原蛋白IireB基因之间加入一段连接肽序列 Linker,构建 CTB-Linker-arei 融合基因；(2)步骤(I)所得CTB-Linker-arM融合基因用BamHI和EcoR I进行双酶切后回收， 连接到载体PBacPAKS，使该融合基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，转化TG1大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组转移质粒pBacPAK8- (CTB-Linker-yre^)；(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pBaCPAK8-(CTB-Linker- rM)和线性化的家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞，通过空斑筛选法筛选阳性，即得到所述家蚕重组杆状病毒 BmNPV- (CTB-Linker-wr^)。上述步骤I)中利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入一段连接肽序列 Linker :AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重叠延伸 PCR 技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与幽门螺杆菌抗原蛋白基因进行融合。上述连接肽序列Linker是编码为(Gly4Ser)n的柔性肽段,其中I彡η彡6。上述家蚕重组杆状病毒BmNPV- (CTB-Linker-wre^)表达的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 7 所示。上述蛋白的制备方法，包括以下步骤(1)将权利要求I所述的重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfrM)感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；(2)针刺接种法接入家蚕蚕蛹或幼虫；(3)收集表达的权利5所述蛋白。本专利技术进一步提供上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。本专利技术还提供上述蛋白在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。本专利技术具有以下有益效果(I)人们对家蚕的驯养已有数千年的历史，积累了丰富的经验，并且现代家蚕人工饲料养殖技术使得家蚕一年四季都可以养殖，大大降低了以家蚕幼虫和蚕蛹作为为宿主进行外源基因的表达的成本；(2)抗原蛋白在家蚕生物反应器中高效表达，解决了口服蛋白亚单位疫苗生产中抗原蛋白需求量的制约瓶颈，而且将口服免疫佐剂与抗原蛋白融合表达作为分子内免疫佐剂增强了免疫效果；小鼠口服实验表明蚕蛹表达的融合蛋白在小鼠血清中产生了明显的免疫效应，为下一步利用蚕蛹生产幽门螺杆菌口服蛋白亚单位疫苗提供了基础。(3)利用家蚕生物反应器将口服免疫佐剂蛋白与抗原蛋白融合表达，并在两者之间加入连接肽片段融合蛋白中口服免疫佐剂作为分子内佐剂比单独应用更能增强抗原蛋白的免疫原性，并且连接肽片段保证了融合蛋白中两蛋白亚单位的构象不发生改变；本疫苗采用口服给药，减轻了注射给药的痛苦，且蚕蛹粉有促进蛋白抗原口服吸收的作用，增强蛋白抗原的免疫原性。附图说明图I为CTB基因PCR扩增的电泳分析图；M DNA标记；1 :阴性对照；2 =PCR产物；图2为CTB-Linker PCR扩增的电泳分析图；M DNA标记；1 :阴性对照；2 =PCR产物； 图3为《τΜ基因PCR扩增的电泳分析图；M DNA标记；I :阴性对照；2: PCR产物； 图4为CTB-Linker-arMPCR融合的电泳分析图；M :DNA标记；1 :阴性对照；2 :融合PCR 产物；图 5 为 pBacPAK8-(CTB本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高国，舒特俊，陈剑清，张耀洲，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。