本发明专利技术涉及的是一种人松弛素2前体及其制备方法，这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列1表示，命名为rhR2。本发明专利技术提供的人松弛素2前体及其优化的基因，使得人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量大幅度提高；该人松弛素2前体的C肽切除使用廉价的羟胺，而不使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶，降低了C肽切除成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种新结构的人松弛素2前体的基因工程制备，具体涉及的是。
技术介绍
松弛素属胰岛素家族，是由两条短肽链通过二硫键连接构成的短肽激素，具有软化生殖道组织、使趾骨联合分离以促进分娩、抑制子宫收缩、刺激乳腺生长与分化、调节卵泡发育、舒张血管、抗炎及促进伤口愈合、影响应激反应及食欲等生理作用。松弛素2可促进 THP-I细胞中cAMP含量的增加。近几年发现，人松弛素被发现在临床上还具有治疗心衰的作用，从而引起人们进一步的关注。目前发现，人的松弛素具有3种不同的氨基酸序列H1、H2和H3，其中H2是最主要的活性存在形式。人松弛素2是有AB两条链组成，其中A链由24个氨基酸残基构成，B链 29个氨基酸残基组成；A、B链之间有两对链间二硫键相连，A链内有一对链内二硫键，见图I。在人体中，松弛素是以松弛素原的状态分泌，其氨基酸一级结构是按B链、C链、A链的顺序排列，其中C链由108个氨基酸残基组成，松弛素原产生后由组织中的转化酶将C链切除后，形成成熟的松弛素。人体内松弛素主要是在妊娠期间由卵巢的黄体产生的，其组织来源很困难，临床上常常使用猪源的松弛素。人松弛素具有强烈地抗心衰作用的发现，极大地拓展了人松弛素的应用领域，并具有极大的市场需求，因此推动了人松弛素制备方法的研究。目前最为常见的制备方式是分别化学合成A和B肽链，然后再进行体外折叠，但因二硫键经常错配而造成产率较低，并且尚需二次纯化，使得化学合成人松弛素的成本较高。国内外也有用哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母等重组表达其前体的报道，但是表达量都较低。同时，多使用 ArgArgGluPheLysArg氨基酸序列作为C肽连接AB链，在将人松弛素前体加工成活性的松弛素时需要使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶进行切割，同时也容易在AB链的Lys或Arg羧基端发生切割，而使重组蛋白招到破坏。陈历明等利用大肠杆菌表达天然人松弛素2原，分离纯化后得率约为2 3 mg/ L，但没有进一步加工和生物活性的报道。Yang等利用酵母表达人松弛素2，经大鼠耻骨联合分析证明其具有生物活性，纯化后的重组蛋白最高可达4(^g/L， 产量并不理想。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种人松弛素2前体，这种人松弛素2前体用于解决现有的人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量低及其C肽切除费用昂贵的问题；本专利技术的另一个目的是提供这种人松弛素2前体的制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是这种人松弛素2前体使用 AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列I表示，命名为rhR2。上述方案中人松弛素2前体的基因序列如序列表中的序列2表示。上述人松弛素2前体的制备方法利用基因重组技术，使用AsnGlyPheAsnGly人工C 肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，再根据表达宿主密码子的偏爱性和该人松弛素2前体氨基酸一级序列，使用酵母偏爱密码子优化该蛋白基因，再通过人工合成该基因序列，然后插入到毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中实现该人松弛素2前体的高效、分泌表达，并保持其天然N端结构。上述方案中人松弛素2前体的制备方法一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZa -rhR2的构建为了便于构建酵母表达载体，在rhR2基因上加入了 Xhol、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了 Kex2切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经lOOPg/mL Amp+抗性LB平板筛选， 获得阳性克隆；阳性克隆经lOOPg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA 小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZ a A质粒分别经Xho I和Xba I双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZ α载体片段，两个回收片段再经Τ4 DNA连接酶于16°C连接IOh ;连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含25Pg/mL Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25Pg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；将经测序正确的重组表达质粒命名为 pGAPZa-rhR2 ；二、转化筛选高表达的重组菌株5-l(^g重组表达质粒pGAPZ a -rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化SMDl 168 菌株,经lOOPg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经40(^g/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YPD培养基中，在30°C、 260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，经Western Blot分析,表达产物可与兔子抗人Relaxin_2抗体发生特异性结合，在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带；获得的最高表达量菌株命名为 G-rhR20上述方案中人松弛素2前体制备人松弛素的方法一、种子液的准备重组酵母G-rhR2在YPD平板上划线分离，30°C倒置培养48h ;提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30°C、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌,2000rmp/min离心IOmin收集沉淀，按200ml YPD培养基IL的摇瓶中，30 °C、260rmp/ min、20h震荡培养，0D600达到4_6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子培养液；二、增值及分泌表达将上述种子液接按I :10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30°C发酵表达， 通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h ；三、发酵液上清的获得及纯化发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液。上清液经O. 22 μ m滤膜过滤后， 经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7. 6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF柱，柱直径I.6cm,柱高 IOcm,洗脱液50mmol/L Tris-HCl, lmol/L NaCl,pH7. 6,流速5mL/min,收集穿透组分，真空低温浓缩；经直径为I. 0cm,高度为30cm的Sephadex G-50进一步分离,用浓度 10 mmol/L, pH 7. 6 的 PBS 洗脱,流速:lmL/min,收集主洗脱峰,进行 Tricine-SDS-PAGE 检测；四、松弛素2前体C肽的切除采用2mol/L pH8.0盐酸羟胺盐切割人松弛素前体的C肽，42°C 4h ;然后使用截流分子量3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10°C搅拌透析12h，透析液的pH值为7. 6，更换透析液4 5次；透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行Tricine本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭德军，王淑慧，厉保秋，韩佳汕，
申请(专利权)人：郭德军，
类型：发明
国别省市：
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