用于纯化粘菌素的方法和纯化的粘菌素组分技术

本发明专利技术涉及一种利用反相色谱法纯化粘菌素的方法，其中，粘菌素基质在乙酸和高乙醇浓度中上柱并且用低乙醇浓度洗脱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种纯化抗生素的方法。
技术介绍
在革兰氏阴性細菌，尤其是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌 (Acinetobacter baumannii)禾ロ肺炎克雷イ白菌(Klebsiella pneumoniae),中提高的多药耐药性提出了一个关键性问题。有限的治疗备选方案已经迫使传染病临床医师和微生物学家重新评估粘菌素(也称作多粘菌素幻的临床应用，粘菌素是一种与多粘菌素B相似但又不完全相同的多粘菌素抗生素。由于粘菌素具有更宽的治疗指数，因此其可具有优于多粘菌素B的明显优势。粘菌素于1947年首次从多粘芽孢杆菌变种粘菌素(Bacillus polymyxa var. colistinus)中被分离，并且由发酵产生的多肽的混合物組成。主要组分是多粘菌素E1,E2、 も和 E1-Ile (图 1)。商业上，粘菌素作为硫酸粘菌素出现，其ロ服用于肠道去污，并且局部施用作为用于皮肤感染的粉剂，以及作为粘菌素甲磺酸钠(colistimethate sodium)，其被肠胃外施用以及通过吸入剂使用。已经发现，与粘菌素相比，粘菌素甲磺酸钠的毒性更小且具有更少的不良副作用，但是药效仍然较低(參见Critical Care 2006，10 :R27 (doi :10. 1186/ cc3995)，作者为 Falagas 和 Kasiokou)。硫酸粘菌素通常被配制成软膏剂、滴耳混悬剂以及耳用溶液和眼用溶液。硫酸粘菌素也作为混悬剂或片剂被ロ服给予以治疗肠道感染，或用于抑制结肠菌群。粘菌素甲磺酸钠是可被用于治疗囊性纤维变性患者中的绿脓杆菌感染的粘菌素的半合成前药，并且其最近已被用于治疗多药耐药性不动杆菌感染。粘菌素甲磺酸钠在鲍氏不动杆菌和绿脓杆菌脑膜炎/室炎中也已经被鞘内给药和室内给药。粘菌素甲磺酸钠在水溶液中容易被水解为各种甲烷磺酸衍生物，并且难以进行分析。因为粘菌素是在50多年之前被引入临床实践的，因此它的性质从未像现代药物那样被详细记录，例如，涉及药理学、毒理学、杂质含量等的具体要求。由于这个原因，可商购的粘菌素产品除了含有主要组分多粘菌素E1之外，还含有很多相关的活性和非活性物质/杂质，大部分来源于发酵过程。图2中示出了粘菌素的典型HPLC色谱图。商品化粘菌素的主要组分，多粘菌素E1 (Polymyxin E1)，通常构成了干产品的大约 60%。粘菌素产品中一些相关的物质已经被表征(图1)，但是大多数杂质仍是未知的。由 USP (United States Wiarmacopoeia，美国药典)指定的硫酸粘菌素的最小效价为“不小于 500 μ g/mg”，但是每种组分的具体抗菌活性在很大程度上还是未知的。尽管该产品已经被使用超过50年，但是没有粘菌素的标准化定量，而且也没有人公开关于药理学和药代动力学的详细试验。因而，用于大多数感染的粘菌素最佳剂量是未知的。同样地，每种制剂的推荐“最大”剂量也是不同的。各国具有不同的粘菌素一般制备方法，而推荐剂量则取决于制造商。硫酸粘菌素和粘菌素甲磺酸钠两者均可被静脉注射给予，以及作为气溶胶给予， 但是剂量是复杂的。来自一些制造商的粘菌素甲磺酸钠处方以国际单位计，而来自其他制造商的相同产品处方以粘菌素基质(base)的毫克数计。这种完全没有任何规则或标准化的剂量使得静脉粘菌素给药对于任何内科医师来说都是ー个可怕的经历。与静脉注射治疗一起被描述的主要毒性是肾毒性(对肾脏造成损害)和神经毒性 (对神经造成损害)，但是这可以反映在早期被给予了非常高的剂量，其比任何制造商目前推荐的剂量要高得多，并且对于肾脏疾病未对其进行调整。与雾化治疗一起被描述的主要毒性是支气管痉挛。在缺少数据支持的情况下，可以推测粘菌素的ー些毒性可能归因于存在于目前商品化产品中的相关物质和杂质。而且，当使用“不纯的”粘菌素作为起始原料来合成粘菌素甲磺酸(colistimethate)前药时，每ー种相关物质和杂质都会形成几种甲磺酸盐衍生物的基质，从而产生非常复杂的终产物一其中每ー种个别物质的毒理学性质都是使未知的。基于上述的毒理学和药理学考虑，可以看出，使用“单组份”的各种粘菌素用于医疗目的具有很大的优势。这样的单组份粘菌素将含有非常高比例的主要组分多粘菌素 E1 (> 90%，与目前60%相比)，所有的主要杂质都被鉴别出并且被表征。单组分粘菌素提供了一些优点1)阐明主要组分(PE1).相关物质和杂质的毒理学贡献的可能性2)经得起新的和更精确的药理学和药代动力学研究检验的产品3)合成定义明确的(well-defined)衍生物的可能性，例如，不产生大量不明确 (ill-defined)物质的粘菌素甲磺酸4)对粘菌素和粘菌素甲磺酸二者开发更好的和更精确的分析方法的可能性，并简化调控程序5)基于清楚的药理学和毒理学数据的明确用药剂量建议6)粘菌素到需求量大的“现代”抗生素的升级由于专利文献或公共领域中均未描述用于制备单组分粘菌素的エ业规模的方法， 因此开发此类产品的制造方法是专利技术人的目的。其次，更长期的目的是对纯化的进行体外和体内效果的重新研究以及毒理学研究，以便与多粘菌素组(group)的之前的研究进行比较。迫切地需要这样的随机和对照试验以便进ー步阐明关于多粘菌素的效果和安全性的各种问题(Crit Care Clin. 2008 Apr ；24 (2) :377-91，作者为 Micholopoulos 和 Falagas)。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于纯化粘菌素组分，并且尤其是主要组分，多粘菌素E1的方法。本专利技术涉及一种生产粘菌素主要组分的几乎纯制剂的方法，该主要组分是多粘菌素E1 (90-98%纯度)，其被称为粘菌素单组分。该方法是ー种使用低毒性溶剂的简单的色谱方法。该方法涉及反相(RP)色谱法， 其使得能够将多粘菌素E1纯化达到超过90%的纯度，随后是疏水作用色谱法(HIC)。该方法的特征是·粘菌素基质在乙酸和高(4M)乙醇浓度中上RP柱·用低(1. 6-2M)乙醇浓度洗脱。出人意料的是，该方法能够被用来从其它主要粘菌素组分中有效地分离多粘菌素し1 ο涉及合适的RP-材料的鉴定工作在10X250mm的钢柱上以实验室规模进行。Merck LiChrospher 60 RP-选择B，15 μ πι(ω)被证明是用于以实验室规模从粘菌素基质纯化PE1的合适树脂，并且该实验室方法在50 X 850mm钢柱上从1克按比例放大到 50克的水平。开发了ー种将粘菌素基质溶解于(4M)乙醇和0. IM乙酸并被分成多粘菌素E 片段的方法。该主要组分PE1以60%的典型回收率和94-98%的相对色谱纯度被分离。在欧洲药典(European Pharmacopoeia, EP)中，ー批/ ー批次硫酸粘菌素的效价被定义为多粘菌素因子PE1, PE2, PE3 > PE1-Ile-PE1-TMOA的总和的％含量，在“原样(as is)”的基础上由HPLC測定。这些因子的总效价应当构成不少于77.0%。此外，EP规定特定因子的最大限值(匪T ；不多于)，例如PE1-Ile(匪T 10%),PEr7M0A(NMT 10%),PE3(NMT 10% )和主要杂质NMT 4%。通过利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：托本·科克，卡斯滕·奥弗巴莱彼得森，
申请(专利权)人：埃克斯利亚制药有限公司，
类型：发明
国别省市：