导电微粒子介导电化学发光信号的免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种导电微粒子介导电化学发光信号的免疫检测方法，包括：a)以一种具有电化学发光活性的导电材料制成微粒子，在微粒子表面固定针对待测物的抗体分子；b)在非电化学发光活性的电极上固定能与a)步中抗体分子形成二元免疫复合物的抗原分子，或固定能与a)步中抗体分子和待测物形成三元夹心免疫复合物的抗体分子；c)加入待测物后，微粒子通过特异性的抗原-抗体免疫反应，在电极表面形成免疫复合物；d)在有电化学发光物质和共反应物存在时，向电极施加电压，在微粒子表面产生电化学发光信号，进而对待测物进行定量测量。本发明专利技术具有背景低、信噪比高等优点，可以实现高灵敏度检测待测物的电化学发光免疫分析方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电化学发光免疫检测
，是一种。
技术介绍
目前在生物化学和生物物质中，对于痕量待测物包括环境污染物、药物、激素、抗体、核酸等的高灵敏度定量筛选和检测已经成为广大研究工作者和临床工作者关注的焦点之一。为了实现痕量待测物的高特异性检测，各种基于生物特异性反应如抗原-抗体技术、 核酸杂交技术、蛋白-配体技术等不同生物化学方法和体系日益发展起来，这种体系可以通过在生物分子上标记不同标记物进行定量检测。例如，最初使用125I作为标记物，通过放射性信号测量进行检测定量。这些方法精密度高，测定可靠，但由于放射性元素的使用，需要建立特殊的实验室，否则对人体会造成很大的伤害。另外，125I有一定的半衰期。为了克服这些缺点，后来发展了使用荧光物质如FITC等作为标记物，采用生物荧光的方法进行检测。但其灵敏度受到了限制。后来在20世纪90年代，Leland等人建立了电化学发光反应系统之后，以电子得失过程中的电位差做能量激发源的电化学发光分析相应建立。电化学发光(ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。在电极上施加一定的电压或电流时，电极上发生电化学反应，在电极反应产物之间、或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态返回到基态时产生发光现象。电化学发光的现象很早就被发现，运用电化学发光进行检测分析的文献报道直至80年代初才出现，90年代开始用于试剂的临床检测中。从整体上讲，电化学发光包括了电化学和化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，但同时与化学发光又有一定的区别和其独特的优势一般的化学发光生物分析的标记物是化学发光反应催化酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或化学发光分子(如鲁米诺、吖啶酯等)，其发光强度受周围环境的影响较大，而且稳定性不高，特别是生物酶。另外，在生物特异性检测时，必须分离游离和结合相，操作步骤较多。而电化学发光免疫分析一般采用联吡啶钌Ru(bpy)32+为标记物，Ru(bpy)32+在三丙胺阳离子自由基(TPA+‘)的催化及三角形脉冲电压激发下，只需毫秒内就可发出稳定的光。 Ru(bpy)32+在发光过程中的再循环利用大大提高了分析的灵敏度；无需将结合相和游离相分开，从而使检测步骤大大简化；小分子的金属配合物作为标记物，稳定性高。因此，电化学发光生物分析有其突出的优点标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化。ECL具有更好的发展趋势。目前报道的电化学发光生物分析方法，主要是将生物分子通过各种不同的技术固定在具有较高电化学发光活性的金、钼金等金属电极或碳、玻碳等非金属电极表面，然后通过特异性结合反应，实现对待测物的电化学发光检测。但是，由于用于电化学发光检测的共反应物TPA在上述电极上都能产生少量的发光，采用这种技术具有无法克服的背景光，因而仍然无法满足痕量物质的检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种，通过克服现有技术中的背景发光问题，建立一种可以实现高灵敏度检测的新型电化学发光免疫分析方法，该方法背景低、信噪比高，可满足痕量物质的检测要求。为达到上述目的，本专利技术的技术解决方案是—种导电微粒子介导电化学发光信号的检测方法，其利用具有生物特异性结合反应性能的导电微粒子介导电化学发光信号；包括步骤a)以一种具有电化学发光活性的导电材料制成微粒子，在微粒子表面固定针对待测物的抗体分子；b)在一个非电化学发光活性的电极上，固定能与a)步中抗体分子形成二元免疫复合物的抗原分子，或固定能与a)步中抗体分子和待测物形成三元夹心免疫复合物的抗体分子；C)加入待测物后，微粒子通过特异性的免疫结合反应，在电极表面形成抗原-抗体免疫复合物；d)在有电化学发光物质和共反应物存在时，向上述电极施加电压，在微粒子表面产生电化学发光信号，进而对待测物进行定量测量。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述微粒子的尺寸是微米级或纳米级；微粒子的形状是圆形、椭圆形或棒状。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述具有电化学发光活性的导电材料，为金、钼金材料，或碳材料。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述的待测物是有机化合物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、单糖、多糖、氨基酸、多肽、或蛋白质。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述非电化学发光活性的电极，是氧化铟锡的金属氧化物电极，或镍金属电极。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述电化学发光分子通过化学方法固定在导电微粒子的表面。所述的电化学发光信号的检测方法，其所述电化学发光物质和共反应物，存在于检测溶液中。本专利技术与现有的其他方法相比具有以下优点1)目前流行的电化学发光免疫方法，均使用具有电化学发光活性的材料作为电极，如金，玻碳电极等。在此类电极上进行检测，共反应物TPA的背景发光较高。本专利技术使用了非电化学发光活性材料如氧化铟锡或镍作为电极，大大降低了 TPA的背景发光。由于微粒子使用具有电化学发光活性的导电材料，特异性免疫反应发生后电化学发光信号的检测不受电极材料的影响。2)在目前流行的电化学发光免疫检测方法中，必须事先通过复杂的化学反应将电化学发光信号分子标记在生物分子上，然后进行免疫反应。本专利技术由于使用了非电化学发光活性材料作为电极，可以将电化学发光信号分子放在检测溶液中，而不产生背景发光。因此，本专利技术免去了繁琐的标记步骤。幻在目前流行的电化学发光免疫检测方法中，标记在生物分子上的电化学发光信号分子的数目有限，一般在10个以下，因而产生的电化学发光信号有限。在本专利技术中，电化学发光信号分子可以固定在微粒子表面。由于微粒子的表面积比较大，可以固定大量的信号分子，每个微粒子上固定的信号分子数目可以高达几十甚至几百个。由此提高了检测信号的强度，进而提高了方法的灵敏度和动态范围。附图说明图1本专利技术的原理图；图2本专利技术的流程图；图3合成的粒径为21nm的金纳米颗粒的透射电子显微镜照片；图4结合在氧化铟锡ITO电极表面的粒径为21nm的金纳米颗粒的扫描电子显微镜照片；图5不同电极在Ru (bpy) 32+/三丙胺体系中的电化学发光信号曲线图，其中，曲线 (a)是结合了纳米金的氧化铟锡ITO电极曲线；曲线(b)是没有结合纳米金的氧化铟锡ITO 电极曲线。具体实施例方式前期科研工作发现，在氧化铟锡、镍等工作电极上，共反应物TPA不能发生电化学氧化反应，因此不产生背景发光信号，与电化学发光分子共存时也不产生电化学发光特异信号。基于上述原理，本专利技术提出了一种利用具有生物亲和反应性能的导电微粒子介导电化学发光的检测方法。本专利技术方法通过特异性的生物亲和反应，将具有电化学发光活性的导电微粒子(金、钼金、碳等)引入到没有电化学发光活性的电极(氧化铟锡、镍等)上，使电极得到活化。在加入电化学发光物质和共反应物后，能在微粒子表面产生电化学发光信号，进而对待测物进行定量测量。当待测物质不存在时，特异性生物结合反应不发生，微粒子不会引入到电极上。由于电极材料没有电化学发光活性，即使有电化学发光分子和共反应物存在，发光强度也非常低，因此检测背景非常低。而当待测物质存在时，微粒子通过特异性生物结合反应被引入到电极上。虽然电化学发光分子和共反应物在非电化学发光活性的电极上不产生电化学发光信号，但它们在高活性的导电微粒子上产生电化学发光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭良宏，黄荣富，赵利霞，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：