本发明专利技术涉及生物样品的检测与鉴别，提供了一种同时快速检测多种核酸的方法。一种同时快速检测多种核酸的方法，包括步骤：A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物中的至少一条带有标记物，各靶标核酸对应的引物所带的标记物不同；B.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。本发明专利技术通过LAMP技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，利用靶标核酸与引物及引物上所带标记物一一对应的关系，检测扩增产物并进行判断，实现准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物样品的检测与鉴别，更具体地说，涉及。
技术介绍
随着现代分子生物学的迅速发展，新的核酸扩增技术不断出现。2000年Notomi 等建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，即环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其特点是针对革E基因的6个区域设计一对内引物、一对外引物共4种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件下进行反应，在Ih内就能扩增出109个靶序列拷贝。LAMP反应的原理以及所使用到内、外引物如图I所示。4条引物中2条为内引物，2条为外引物。其中，内引物FIP(forward inner primer)包含Flc序列和F2 (F2c区域的互补序列)，即5' _Flc_F2 ;内引物BIP (backward iner primer)包含Blc (BI区域的互补序列)和B2序列，即5' _Blc_B2。外引物为F3和 B3序列。LAMP技术特异性强、灵敏度高、过程快速、操作及结果判定简单，广泛应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发。LAMP技术的结果判定方法常用的有三种(I)琼脂糖电泳检测，若扩增条带呈明显梯状分布说明扩增成功；(2)焦磷酸镁作为LAMP的副产物是一种肉眼可见的白色沉淀，可以直接通过肉眼判断确定有没有扩增产物；(3)反应后在体系中加入SYBR GREEN I 1-2 μ L，如果体系中颜色呈橙色，说明扩增失败；如果颜色呈绿色，说明存在扩增产物。当样品中只含有一种待测核酸时，LAMP技术简单快速易用；但是，利用现有LAMP技术对样品中可能存在的几种核酸进行检测时，上述判定方法只能区分样品中是否含有待测的核酸，却无法区分含有几种，或具体哪几种，检测结果不够准确。因此，迫切需要一种新的同时快速检测多种核酸的方法，该方法能够同时快速检测多种核酸，并且能根据检测结果区分待测样品中具有哪几种核酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，旨在解决现有技术中同时检测多种核酸时，不能准确区分待测样品中含有哪几种核酸的问题。为了实现本专利技术的目的，本专利技术是这样实现的，，包括以下步骤A.利用与多种靶标核酸分别对应的引物，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物中的至少一条带有标记物，各靶标核酸对应的弓I物所带的标记物不同；B.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。其中，所述步骤B之前还包括步骤CN 102586439 A B’ .对LAMP扩增反应之后的产物进行纯化，得到带标记的扩增产物。其中，所述步骤A之前还包括步骤A’ .对待测样品进行处理，得到待测靶标核酸处理液。进一步的，所述步骤A’中的对待测样品进行处理的方法采用冻融处理、通透处理和核酸提取中的至少一种。其中，上述步骤A’中对样品进行处理，其目的是使待测多种核酸的序列能够暴露于后续的扩增体系中，能够让带有不同标记的引物结合其上顺利进行LAMP扩增。其中，所述步骤A中的标记物，与引物结合的连接形式为R1-R-R2，其中Rl为引物上携带的末端基团，R2为标记物上所携带的末端基团，R则为Rl与R2之间形成的化学键或中间偶联剂。其中，上述步骤A中的标记物，包括但不限于放射性物质、抗原、半抗原、抗体、 酶、生物素、寡核苷酸标签或荧光标记物。其中，所述标记物为寡核苷酸标签，该寡核苷酸标签优选位于内引物中。所述内引物如图I中所示，以FIP为例，该内引物包含Flc序列和F2-(F2c区域的互补序列)两部分， 即5' -F1C-F2，其互补靶标序列相对外引物F3的位于靶标序列内部，因此称为内引物。当寡核苷酸标签位于内引物时，只能位于内引物中Flc与F2两部分连接的中间位置。进一步的，若上述标记物为寡核苷酸标签，则步骤B中所述检测方法采用荧光探针杂交法、基因测序法中的至少一种；若上述标记物为荧光标记物，则步骤B中所述检测方法采用光谱分离法。上述光谱分离法是指利用不同荧光标记物的激发光谱与发射光谱不同的特点，采用多色分光仪进行光谱分离从而准确区分扩增物的方法。其中，上述待测样品包括但不限于食源性致病菌、病毒或临床检测样品。其中，上述步骤A中扩增反应体系中包含有尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil-DNA Glycocasylase, UDG)。由上可知，本专利技术所述同时快速检测多种核酸的方法，通过LAMP技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，根据待测的多种靶标核酸设计相对应带标记物的引物，扩增完成之后，通过检测扩增产物上携带的标记物进行判断，实现准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸的目的；同时在扩增反应体系中加入UDG酶，防止假阳性现象的出现， 确保检测结果的正确性。附图说明图I是LAMP反应原理示意图；图2是本专利技术流程图；图3是本专利技术一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程图；图4是本专利技术另一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法流程图；图5是本专利技术一个实施例中同时快速检测多种核酸的方法示意图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对4本专利技术进行进一步详细说明。图2示出了本专利技术，包括以下步骤SI.利用与多种靶标核酸分别对应的引物，在同一反应体系中，对待测样品同时进行多种靶标核酸的LAMP扩增，得扩增产物；与每种靶标核酸对应的引物中的至少一条带有标记物，各靶标核酸对应的弓I物所带的标记物不同；S2.对扩增产物所携带的标记物进行检测，并根据标记物的检测结果判定待测样品中所含有的靶标核酸的种类。本专利技术所述同时快速检测多种核酸的方法的优点在于利用LAMP扩增技术在同一反应体系中同时快速检测多种靶标核酸，根据待测的多种靶标核酸设计相对应带不同标记物的引物，扩增结束后，通过对扩增产物上所携带的标记物进行检测，进而判断有哪些带标记的引物得到了扩增，从而根据引物与靶标核酸之间的一一对应关系准确区分待测样品中含有哪几种靶标核酸。需要说明的是步骤SI中，所述多种靶标核酸是指待测样品中所包含的多种待测核酸，包括直接得到的或者是经过处理间接得到的，其种类包括但不限于基因组DNA、RNA或cDNA。所述待测样品包括但不限于食源性致病菌、病毒或临床检测样品。在本步骤之前还可以包括对待测样品进行处理的步骤，所述对样品进行处理的目的在于使待测样品中的多种靶标核酸序列能够暴露于后续的扩增体系中，能够让带标记物的引物结合其上并顺利进行LAMP扩增。对于处理方法，只要能满足上述目的即可，结合后续图示将给出不同的优选处理方法。步骤SI中所述的引物对应于不同靶标核酸，两者之间一一对应；且对应每一种靶标核酸的引物中的至少一条引物带有标记物，引物与标记物之间也一一对应，即不同靶标核酸的引物所带的标记物不同。所述标记物，可以使用已知的标记物和方法与引物结合，其结合的方式以及结合的位置可以多变，原则上只要不抑制引物与模板链结合以及后续的延伸反应。标记物可以为多种物质，包括但不限于放射性物质、抗原、半抗原、抗体、酶、生物素、寡核苷酸标签或荧光标记物。标记物与引物之间一一对应，两者结合后的连接形式为R1-R-R2，其中Rl为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，
申请(专利权)人：盛司潼，
类型：发明
国别省市：
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