一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤：(1)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥；本发明专利技术的优点在于：(1)所得酶活力高、安全可靠；(2)工艺对超滤膜污染小，同时生产效率高；(3)使菠萝蛋白酶的生产不受菠萝采收期的限制；(4)可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝清汁两种产品；(5)工艺灵活，可选超滤或盐析收集菠萝蛋白酶，使用盐析法时，菠萝蛋白酶溶液的体积只有原菠萝汁的1/20，所用盐量大大减少。

【技术实现步骤摘要】
—种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法
本专利技术涉及菠萝蛋白酶的提取方法，特别涉及一种用壳聚糖羧化衍生物提取果菠萝蛋白酶的方法。
技术介绍
菠萝蛋白酶(简称菠萝酶)是从菠萝植株中提取的一类多肽水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中。根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶(EC3. 4. 22. 32)和果菠萝蛋白酶(EC 3. 4. 22. 33)。从菠萝皮、果中提取的为果菠萝蛋白酶，从菠萝茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。本专利技术是针对果菠萝蛋白酶的分离提取。菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，具有很强的水解活性，在食品、生物化学领域有广泛应用。同时，由于其能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝块溶解，促进药物对病灶的渗透和扩散，且不破坏凝血所必需的纤维蛋白原，因而在医药领域也有很好的应用前景。目前，受酶活力低和原料供应不稳定的限制，其在医药领域的应用还未完全开发。目前提取菠萝蛋白酶的方法可归为三类，即盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法。盐析法，如张桂香(张桂香，王元秀，矫强，等.盐法提取菠萝蛋白酶的研究.食品工业科技，2004，(6) :103-104.)报道了用(NH4)2SO4沉降提取菠萝蛋白酶的方法。其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加苯甲酸钠-io°c加白陶土 _吸附沉降_收集沉淀物_复溶_加(NH4) 2SO4-洗脱-粗酶液_调节pH-精酶液。简化的盐析法在小型企业中比较常见，具体步骤为菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加 (NH4)2SO4-收集沉淀-干燥。盐析法所得酶的活力低，盐使用量多、如(NH4)2SO4的添加量一般为菠萝汁体积的20-25%，(NH4)2SO4F易回收，菠萝汁也不能回用，工艺比较落后。有机溶剂沉淀法，如中国专利CN101696404A提供了一种通过有机溶剂沉降来提取菠萝蛋白酶的方法。菠萝经清洗榨汁后，滤液用聚丙烯酸吸附沉降，沉淀物用醋酸钙溶液处理，使菠萝蛋白酶游离出来，得到菠萝蛋白酶粗酶液，再经透析、冷冻干燥后，得到菠萝蛋白酶干粉。这种方法操作简单、快速、高效、分离量大、聚丙烯酸原料来源广泛，但实际操作中，聚丙烯酸受其单体制备方法的影响，其中常残留丙烯酰胺，这是一种有毒有害成分，在食品等行业中是限制使用的，且聚丙烯酸具有成膜性，能快速地在溶液中形成分子膜，阻碍透析的进行，不利于菠萝蛋白酶的纯化。超滤法，如中国专利CN1908165A提供了一种超滤法提取菠萝蛋白酶的方法。它包括以下步骤原料-清洗-粗粉碎-细粉碎-预处理-榨汁-离心-冷冻-过滤-超滤-干燥-成品，该工艺依靠先进分离提取手段，所用人工较少，酶活力也较高，缺点是菠萝汁不经去糖、去杂碎细胞处理，直接超滤，超滤膜易被污染，每次使用前后都要进行清洗，清洗时间超过生产时间，而且重复使用效果差，需频繁更换膜块，生产成本较高。因此，目前还需要提供一种提取菠萝蛋白酶的方法，该方法能够解决盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法提取菠萝蛋白酶存在的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种原料是纯天然产物、无毒无害、来源广泛，工艺操作简便、生产效率高，产品纯度好、活力高的菠萝蛋白酶的提取方法。具体地说，本专利技术提供了。该方法包括如下步骤(I)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥。该方法可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝汁两种产品，二者的生产互不干涉，且菠萝汁透明澄清，无需离心等处理，可直接回收再利用.本专利技术的具体实施方案如下(I)壳聚糖羧化衍生物的制备称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；(2)菠萝汁预处理将菠萝果皮清洗后榨汁,过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO3、半胱氨酸和 EDTA (乙二胺四乙酸)，缓慢搅拌均匀；(3)菠萝蛋白酶的吸附称取适量的步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物， 加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈；回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物；(4)菠萝蛋白酶的洗脱配制适量的一定浓度和pH的NaHCO3溶液，将步骤(3)得到的复合物溶于NaHCO3溶液中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl2溶液，搅拌均匀后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下，离心10 分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥配制一定浓度和pH的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为IOK的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶， 盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液PH值至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH4)2SO4，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。本专利技术所述的用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，作为步骤(I)，所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的浓度，可优选的以质量浓度计为O. 8 I. I %，最优选的为1% ;所述饱和NaOH溶液的用量，可优选的是其溶质质量为壳聚糖的O. 65 O. 80倍，最优选的为O.75倍；所述的固体氯乙酸的用量,可优选的为壳聚糖质量的I. I I. 3倍,最优选的为I.2倍；所述的反应温度，可优选的为65 75°C，最优选的为70°C ;所述的反应时间，可优选的是2. 5 3. O小时，最优选的为2. 7小时；所述的烘干温度，可优选的为60 70°C，最优选的为65°C。作为步骤(2)，所述的滤液置于的温度，可优选的为8 14°C，最优选的为 I TC ;所述的单位体积菠萝汁中粉末NaHSO3的加入量，可优选的为3X 10_4 4X 10_4g/L， 最优选的为3. 5X 10Vl ;所述的单位体积菠萝汁中粉末半胱氨酸的加入量，可优选的为5.5 X 10_5 6. 5 X 10_5g/L，最优选的6. O X 10_5g/L ;所述的单位体积菠萝汁中粉末EDTA (乙二胺四乙酸)的加入量，可优选为4. 5X10—4 5. 5X10_4g/L，最优选的为5.0X10_4g/L。作为步骤(3)，所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量，可优选的为I 3. 5g/ L，最优选的为2. 5g/L。作为步骤(4)，所述的NaHCO3溶液的浓度，可优选的为O. 05 O. 12m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩志萍，黄茂芳，李普旺，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：