本发明专利技术公开了一种能识别β-胡萝卜素类色素的特异性单克隆抗体和一种用于检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫方法及试剂盒。本发明专利技术的单克隆抗体是由杂交瘤细胞DCC/C11所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：C201146。本发明专利技术的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。本发明专利技术的酶联免疫检测方法及试剂盒能一次性测出样品中斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸的总含量，缩短了检测时间，降低了检测成本，同时具有检测灵敏度高、精密度好、准确性好的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能识别β -胡萝卜素类色素的单克隆抗体和一种用于检测β -胡萝卜素类色素的酶联免疫方法及试剂盒。
技术介绍
β -胡萝卜素类色素有β -阿朴-8’ -胡萝卜素醛、β -阿朴-8’ -胡萝卜素酸乙酯、叶黄素、辣椒红、斑蝥黄、虾青素等。目前，对β-胡萝卜素类物质的检测方法主要是仪器检测法，如纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法、高效液相色谱或液质联用法。这些检测方法需要配备昂贵的仪器和专业性强的操作人员，样品的前处理复杂，检测时间长，不利于大批量样品的筛选， 不能在现场进行快速的检测。酶联免疫检测方法(ELISA)是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术。它具有操作简便、高通量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足。目前，国内外没有针对β_胡萝卜素类的ELISA检测方法的文献报道。对于小分子化合物ELISA检测方法的建立，小分子化合物的抗体制备是核心部分，而合理设计半抗原又是关键。半抗原的化学结构不同，连接到载体蛋白上的化学位点就不同，交联臂的化学性质也不同，而这是影响小分子化合物抗体性质的决定性因素。因此对小分子化合物进行化学结构改造，合理设计半抗原，将半抗原连接到载体蛋白上，是该专利技术的核心。申请人:检索到一篇申请号为201010140887.6的专利技术专利，该专利提供了一种氧化α-紫罗酮和β_紫罗酮的方法，但是并没有将其作为半抗原合成免疫原及应用于酶联免疫检测。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种能识别β_胡萝卜素类色素的单克隆抗体。本专利技术的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能检测β_胡萝卜素类色素的ELISA方法。本专利技术的第三个目的是提供一种检测β_胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测β_胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒中的应用。本专利技术的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物组织β-胡萝卜素类色素残留检测中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种能识别β_胡萝卜素类色素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO C201146杂交瘤细胞DCC/C11所分泌的。所述胡萝卜素类色素指的是斑蝥黄、β -胡萝卜素、β -阿朴_8’ -胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、紫罗酮酸。所述杂交瘤细胞DCC/C11保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCC NO C201146o所用的免疫原是通过半抗原β_紫罗酮酸与牛血清白蛋白偶联制备得到的。进一步，本专利技术提供了一种检测胡萝卜素类色素的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下(I)将半抗原β_紫罗酮酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；(2)将半抗原4-氧代-β-紫罗酮酸与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201146的杂交瘤细胞DCC/C11 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201146的杂交瘤细胞DCC/C11制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体；(6)将待测样品用体积比为乙酸乙酯氢氧化钠(2% ) = 2 : I的混合溶液提取， 经乙酸乙酯萃取和氮气吹干后，残渣用样品稀释液溶解得到待测物；(7)对步骤￠)的待测物进行酶联免疫检测，其中样品稀释液的组分及配比为=NaCl8. 0g, KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KCl O. 2g，N，，N，- 二甲基乙酰胺20mL，加双蒸水至IOOOmL0本专利技术以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对胡萝卜素类色素的酶联免疫检测。本专利技术的有益效果是I、本专利技术制备的单克隆抗体能识别β -胡萝卜素类色素中的斑蝥黄、β -胡萝卜素、β-阿朴_8’ -胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β_紫罗酮酸，专属性强，灵敏度高。2、由于本专利技术采用β_紫罗酮酸作为半抗原，该半抗原保留了斑蝥黄、β_胡萝卜素、β -阿朴_8’ -胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素所共有的化学结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别斑蝥黄、β -胡萝卜素、β -阿朴_8’ -胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、 β-紫罗酮酸。3、本专利技术的ELISA方法和试剂盒能一次性测出待测物中斑蝥黄、β-胡萝卜素、 β-阿朴-8’ -胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β_紫罗酮酸的总含量，缩短了检测时间，降低了检测成本。4、本专利技术的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度高、精密度好、准确性好。附图说明附图I为本专利技术的技术路线图。附图2为本专利技术的单克隆抗体与斑蝥黄(CTX)标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为斑蝥黄(CTX)标准溶液浓度对数值，Y轴为斑蝥黄标准品溶液的光密度值除以 “零”孔光密度值(Β/Β0)。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术做进一步说明。实施例I免疫原和包被原的制备I. I β -紫罗酮酸的合成准确量取蒸馏水30mL，加入到预冷的圆底烧瓶中；向烧瓶中加入液溴20g，搅拌2 小时后，形成A液备用。准确β_紫罗酮6g，溶解于二氧杂环己烷20mL中，形成B液。将B 液加入A液中，室温下反应8小时。反应完成后，加入20%亚硫酸氢钠直到淀粉碘化钾试纸不再变蓝。然后加入浓盐酸至溶液中出现白色固体物质。过滤，将滤渣白色固体物质投入甲醇中，置60°C水浴搅拌至完全溶解后，过滤。将滤液置于_20°C过夜后过滤，滤饼置于 50°C真空干燥箱中干燥，得到的产物进行质谱鉴定为β_紫罗酮酸。1.2 β-紫罗酮酸-BSA的合成取β -紫罗酮酸93mg，1,3- 二环己基碳二亚胺(DCC) 50mg和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 33mg溶解于二氧杂环己烷5mL，室温避光搅拌8小时，反应产物过滤后形成A液。另取 BSA80mg溶解于磷酸盐缓冲液(O. 01mol/L, pH8. O) 20mL中，形成B液。冰浴搅拌下，将A液滴加到B液；将反应12小时后的反应液于4000r/分钟离心10分钟；取上清装入透析袋中， 对生理盐水透析5-6天，即得偶联物β-紫罗酮酸-BSA。离心后取上清冷冻干燥，置_20°C 保存，作为免疫原。1.3 4-氧代-β-紫罗酮的合成将β-紫罗酮20g和二氯甲烷60ml加入到三口瓶中；水浴加热至37°C，加入15ml 含有2g碘化钾的水溶液和6ml含有3g硫酸氢钠的水溶液。搅拌条件下，再加入含有8g溴酸钠的20ml水溶液,反应完成后，分离有机相。该有机相用8g无水硫酸镁干燥后,旋蒸浓缩。用石油醚和丙酮进行柱层析，分离目标物质。将分离出来的目标物质旋蒸浓缩后，加入同体积的石油醚，置_20°C过夜后过滤。滤饼置于50°C真空干燥箱中干燥，得到的产物进行质谱鉴定为4-氧代-β -紫罗酮。I. 4 4_ 氧代 β -紫罗酮酸(4-keto-β-ionone acid)的合成准确称取NaOH4g,溶于20mL水中，滴入溴素2mL,继续搅拌。称取4_氧代-β -紫罗酮粗品I. 2g，溶于二氧杂环己烷4mL，加入上述活化好的反本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，王玉莲，廖峰，彭大鹏，潘源虎，黄玲利，陈冬梅，陶燕飞，戴梦红，刘振利，闫彩霞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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