本发明专利技术提供一种耐重金属Zn的构树内生真菌的分离筛选方法，及构树内生真菌在修复重金属污染土壤中的应用，本发明专利技术还提供一种具有抗人肝癌细胞活性的构树内生真菌的分离筛选方法、一种具有抗人肝癌细胞活性的发酵液的制备方法，及构树内生真菌在制备抗人肝癌细胞活性药物中的应用，本发明专利技术还提供一种具有抗炎活性的构树内生真菌的分离筛选方法、一种具有抗炎活性的发酵液的制备方法，及构树内生真菌在制备抗炎活性药物中的应用，本发明专利技术的优点在于从构树中成功筛选出耐重金属Zn、具备抗人肝癌细胞活性、具备抗炎活性的构树内生真菌，提供了有效的菌种分离筛选方法，为重金属污染土壤的生物修复提供了切实可行的方法，并且开辟了抗癌、抗炎药物研发的新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
，具体地说，是构树内生真菌在植物修复和制备抗菌抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
植物内生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各组织和器官内的真菌。它们与宿主植物通过互作形成了紧密的共生关系。内生真菌可以促进植物的生长，提高植物应对生物或非生物胁迫的适应能力。例如，从重金属胁迫环境下植物体中分离得到的内生真菌Mucor sp. CBRF59对Cd和1 有很强的抗性与富集能力，具有促进植物生长和重金属富集的双重特性(Chen L., Luo S., Xiao X.，Guo H. , Chen J. , Wan Y. , Li B. , Xu Τ. , Xi Q. , Rao C. , Liu C. , Zeng G. Application of plant growth-promoting endophytes (PGPE) isolated from Solanum nigrum L. for phytoextraction of Cd-polluted soils. Applied Soil Ecology, 2010,46 (3), 383-389 ；Deng Ζ. , Cao L. , Huang H. , Jiang X. , Wang W. , Shi Y. , Zhang R. (2011). Characterization of Cd- and Pb-resistant fungal endophyte Mucor sp. CBRF59 isolated from rapes (Brassica chinensis) in a metal-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials, 2011，185 0-3) : 717-724.)。有些植物内生真菌还被证实具有药用价值，如1993年Mierle首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，中国专利文献CN 200810041214. 8，公告日2010年9月四日，公开了一种抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，则发现植物内生真菌长枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)发酵产物可抑制肝癌细胞生长。构树(Broussonetia papyrifera (L. ) Vent.)为桑科构属植物，是一种内生真菌宿主植物，呈现丰富的内生真菌多样性，构树与其内生真菌存在协同进化或互作关系。构树具有重金属富集特性，如黄长干等(2004)调查发现江西德兴铜矿污染区域的构树具有良好的植物修复潜力，其生物量在140余种植物中位列第一；赖发英等(2007)调查结果表明构树对污染农田的Cu、Zn具有富集能力；童方平等(2010)对锑矿区构树富集重金属的特性研究发现，重金属Sb、ai、Pb、As主要富集在构树的枝叶部位(占85%以上)。以往的研究认为，内生真菌与宿主植物富集重金属的能力有密切的关系，包括内生真菌在内的微生物在重金属污染环境中逐渐形成了一些对重金属抗性的种群，它们通过生物吸附、胞外沉淀、生物转化、生物累积和外排作用对重金属毒性产生抗性，并可分泌多聚糖、糖蛋白、脂多糖、可溶性氨基酸等胞外聚合物质，选择性地从环境中结合金属，可用于污染环境的生物修复。如通过生物吸附或积累作用去除废水中的重金属，与内生真菌-植物联合修复重金属污染土壤。由于内生真菌呈丝状生长，接触污染面积大，且生长快，生物量大，分离培养简单，多数内生菌寄主范围广，协同利用微生物和宿主植物对重金属污染土壤进行修复，可以改善植物修复效果，具有广阔前景。但是对于某一宿主植物，究竟何种内生真菌或哪几类内生真菌起到重金属富集作用，是需要进行大量的研究加以证实的，这类内生真菌的筛选出来以后， 可制备成菌根菌剂，从而应用于生物修复。目前关于构树内生真菌尚未见有分离鉴定的报道，也未见有重金属抗性及生物活性方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐重金属Si的构树内生真菌的分离筛选方法。本专利技术的再一的目的是，提供构树内生真菌在修复重金属污染土壤中的应用。本专利技术的另一的目的是，提供一种具有抗人肝癌细胞活性的构树内生真菌的分离筛选方法。本专利技术的第四个目的是，提供一种具有抗人肝癌细胞活性的发酵液的制备方法。本专利技术的第五个目的是，提供一种构树内生真菌在制备抗人肝癌细胞活性药物中的应用。本专利技术的第六个目的是，提供一种具有抗炎活性的构树内生真菌的分离筛选方法。本专利技术的第七个目的是，提供一种具有抗炎活性的发酵液的制备方法。本专利技术的第八个目的是，提供一种构树内生真菌在制备抗炎活性药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种耐重金属ai的构树内生真菌的分离筛选方法，它包括以下步骤(a)材料预处理采集新鲜构树的根、茎段和成熟叶，用双蒸水冲洗干净后，无菌水略洗；(b)材料消毒将步骤(a)的构树成熟叶用75%EtOH漂洗lmin，无菌水冲洗，2. 5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0. 5min,无菌水冲洗；步骤(a)的构树根和茎段用75% EtOH漂洗lmin，无菌水冲洗，5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗 0. 5min，无菌水冲洗；(c)构树内生真菌的分离将步骤(b)的成熟叶用无菌滤纸吸干水分后切成组织块， 根、茎段剥去根皮亦切成组织块，接入PDA培养基；(d)构树内生真菌的纯化将分离繁殖出的不同种类的构树内生真菌接入PDA平板纯化；(e)含重金属Si的培养基的配制PDA培养基高温灭菌后，加入150-250mmol/L无菌的SiSO4 · 7H20轻轻振摇使其溶解均勻；(f)耐受重金属Si构树内生真菌的筛选将步骤(d)所分构树内生真菌接种在步骤(e) 的培养基上，26°C培养一周，挑出长出的菌落，即为重金属Si耐受菌株。所述的PDA培养基各组分及质量百分比为土豆20%，葡萄糖2%，琼脂1. 5%，余量 *Η20，ρΗ 自然。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是构树内生真菌在修复重金属污染土壤中的应用，所述的构树内生真菌是按照上述耐重金属ai的构树内生真菌的分离筛选方法分离筛选得到的。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种具有抗人肝癌细胞活性的构树内生真菌的分离筛选方法，它包括以下步骤(a)材料预处理采集新鲜构树的根、茎段和成熟叶，用双蒸水冲洗干净后，无菌水略洗；(b)材料消毒将步骤(a)的构树成熟叶用75%KOH漂洗lmin，无菌水冲洗，2. 5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0. 5min,无菌水冲洗；步骤(a)的构树根和茎段用75% KOH漂洗lmin，无菌水冲洗，5% NaCHO漂洗;3min，无菌水冲洗，75% KOH漂洗 0. 5min，无菌水冲洗；(c)构树内生真菌的分离将步骤(b)的成熟叶用无菌滤纸吸干水分后切成组织块， 根、茎段剥去根皮亦切成组织块，接入PDA培养基；(d)构树内生真菌的纯化将分离繁殖出的不同种类本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宝康，张春燕，秦路平，贾敏，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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