本发明专利技术公开了一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记WH-SSR-1，开发此标记所用的核苷酸引物序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示，应用此标记检测洋葱样本的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。本发明专利技术的洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记及引物可以用于鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型：提取待检测洋葱样本的叶片总DNA，经引物PCR扩增后，检测扩增产物的大小。本发明专利技术的分子标记不仅克服了以往分子标记的不足，而且避免了常规方法繁琐的筛选过程，还可以节省4-6年杂交测交时间以及此过程中大量人力、物力消耗，从而使得其操作过程更简单、有效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记，该标记的开发可直接应用于洋葱分子标记辅助育种，属于生物
技术介绍
洋葱(Allium cepa. L),又称圆葱、葱头,百合科、葱属，二年生植物，已有5000多年的栽培历史。据2009年FAO统计，至少有175个国家栽培洋葱。世界洋葱种植面积370 万公顷，产量7230万吨，在所有的蔬菜作物中，其种植面积居第二位，产量居第三位；其中， 我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积超过100万公顷，总产量2107万吨，约占全世界产量的30%。洋葱素有保健食品的美称，不仅可鲜食，还大量用于加工，具有降低和预防血栓形成，降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用，深受消费者的喜爱。我国洋葱栽培历史较短，品种资源较匮乏，目前种植的品种可分为红皮、黄皮及白皮洋葱，栽培品种以常规品种为主。随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加，但是目前生产上主要以进口杂交种和一些常规种选育为主，缺少具有自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子，使出口创汇蔬菜生产的成本居高不下。为了改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，尽快研制出具有我国自主知识产权的洋葱杂交种，其关键在于广泛收集品种资源的同时解决洋葱育种周期长的问题(为普通蔬菜作物白菜、萝卜的2-4倍)。加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究，走现代分子生物学与常规育种相结合的道路；加快育性材料的鉴定工作已成为目前亟待解决的难题，是洋葱杂交育种选育的关键环节。目前，在洋葱雄性不育的鉴定中，细胞质鉴定的分子标记研究已经取得了显著的进展。但是在细胞核鉴定上，由于洋葱基因组DNA巨大(17. 9pg)，每I条染色体上的核苷酸有15，290Mbp，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍。G0kge和 Havey 在两个开放授粉的洋葱群体内，以A0B272(0. 9cM)标记为辅助工具，尝试选择保持系，但发现该标记与保持系几乎没有关联，作者认为可能是因为在长久的开放授粉环境下，A0B272标记与Ms位点之间已经进行了充分的染色体交换，因此只用该分子标记无法准确地选出保持系。在我们以前的研究中，已开发了一个与雄性不育育性恢复基因相关的cDNA分子标记(WHR240)，而且该标记在多个洋葱材料中得到验证，但是因该标记是以反转录的特定时期、特定组织的cDNA 为模板，因此在操作和具体利用上具有一定的局限性(RNA的提取、反转录等前提条件以及单显性标记)，在大规模的育种材料鉴定工作上还存在着一定的局限性。另外，山东省农业科学院蔬菜研究所葱姜蒜研究中心(以下简称研究中心)在洋葱雄性不育基因位点的分子标记方面取得了突破性进展，已经开发了与洋葱雄性不育基因ms和育性恢复基因Ms紧密连锁的共分离DNA分子标记，应用该标记能够准确判断Ms或ms基因的是否纯在，但是由于不是共显性标记，不能一次扩增来完成基因型的判断，必须分别用不育基因连锁标记和育性恢复基因标记进行扩增后，根据两次获得的结果综合判断基因型，而且还存在对扩增失败有错判的可能性。而一种共显性的DNA标记可以通过单次验证的结果来准确地判断雄性不育位点的基因型(MsMS、MSmS、mSmS)。因此，一种共显性DNA分子标记的开发将成为辅助洋葱雄性不育杂交种选育的最有效的方法。SSR(Simple Sequence Repeat)简单序列重复也称微卫星DNA，串联重复的核心序列为l-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，S卩(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同，是一种共显性分子标记。SSR标记的基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。ESTs (expressed sequence tags)是指从不同组织来源的cDNA 文库中随机挑选克隆进行5'或3'端测序后得到的长约300-400bp的基因表达序列片段。 利用多种生物信息学分析软件，对序列进行前处理，然后设计SSR引物，电泳分析扩增片段的大小。SSR标记的开发还可应用于遗传图谱的构建、DNA指纹图谱的建立、种质资源多样性研究。因此，一种共显性DNA核标记的开发不仅可以减少鉴定杂交后代的工作量、试验成本、保持系选育的时间，而且可以直接通过一次试验就能够直接鉴定出样品在Ms位点的基因型(MsMS、MSmS、mSmS)。获得洋葱细胞核育性标记，对于筛选洋葱雄性不育系和配套保持系，选育洋葱杂交种满足市场需求，填补洋葱杂交育种领域上的空白，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术根据研究中心已测序的洋葱AFLP片段序列，两端设计引物分别扩增可育基因池和不育基因池，测序后用DNAMAN软件分别比对两个基因池的不同克隆之间序列差异，利用misa软件搜索SSR位点以及primer3设计SSR弓I物，PCR 试验、 聚丙烯酰胺凝胶电泳等分子生物学实验方法，开发出了一个能够区分洋葱核基因Ms位点的共显性 SSR 分子标记 WH-SSR-I ，该标记的开发对洋葱雄性不育基因Ms位点基因型 (MsMs、Msms、msms)的准确、快速鉴定,加速洋葱杂交种的选育进程,具有重要意义。一种洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记WH-SSR-1，引物核苷酸序列为USSR-I 5/ TTAACGTCATCAACCGTTCAT 3'，如 SEQ ID NO. I 所示；DSSR-I 5/ TTGGCTTCATCTCCRCTTC 3'，如 SEQ ID NO. 2 所示；开发此标记所用的上游引物AFLP-U的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物AFLP-D的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示AFLP-U 5/ TTAACGTCATCAACCGTTCAT 3 ；AFLP-D 5/ GGGACAAAAGAATAGCAATATG 3'。所述洋葱雄性不育基因Ms位点共分离的SSR共显性分子标记及引物可以用于鉴别洋葱雄性不育基因Ms位点基因型，应用时步骤如下提取待检测洋葱样本的叶片总DNA， 经引物PCR扩增后，检测是否有扩增产物，若只有一条102bp的扩增带，则 Ms位点基因型为纯合显性(MsMs)，若只有I条99bp的扩增带，则Ms位点基因型为纯合隐性(msms)，若有102bp、99bp两条扩增，则Ms位点基因型为杂合(Msms)。所述提取待检测洋葱样本的叶片总DNA采用CTAB法提取。所述PCR扩增的反应体系为25μ L体系，其中2. 5μ L 10XPCR Buffer with Mg2+ ；4. 0μ L dNTPs of each 2. 5mM ;各 I μ L 10ymol/L of Primer ；0.5 μ L Taq DNA polymerase (5u/ μ L) ；1 μ L Onion DNA Template ； 15 μ L CldH2O0反应程序为94 °C预变性4min，，30本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雄，霍雨猛，杨妍妍，刘冰江，缪军，
申请(专利权)人：山东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：
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