生物人工内脏器官的制造方法技术

技术编号:7601003 阅读:218 留言:0更新日期:2012-07-22 03:06
本发明专利技术在于提供一种从干细胞分化诱导成组织细胞之方法,以及包含所得之组织细胞的生物人工内脏器官。进一步在于提供一种包含所制造之生物人工内脏器官的医疗用材料。解决方式为利用具有增殖能力、自我复制能力、分化能力的干细胞并通过悬滴法(hanging?drop?method)来进行培养,由此以三维方式构建胚体(embryonic?body)细胞块,并通过在HGF、GDNF、b-FGF、BMP7及EGF的存在下,对所述细胞块进行培养即可分化成组织细胞。又可使用分化成组织细胞的细胞来制造生物人工内脏器官,而能够进一步提供医疗用材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用培养细胞将干细胞分化诱导成组织细胞的方法。本专利技术还涉及一种包含所分化诱导之组织细胞的,更进一步涉及包含所得之生物人工内脏器官的医疗用材料。
技术介绍
近年来,组织工程学已受到关注,在组织工程学中,对疾病或事故等原因所丧失或功能下降的内脏器官或组织,意图使其功能恢复、或使内脏器官或组织本身再生。在此组织工程学的领域中,正在对使干细胞或未分化细胞得以增殖、分化成目标细胞的培养条件或因素进行研究。一般而言,组织工程学需要细胞、生长因子及细胞赖以植入(engraft)的立足点三种要素。而且,于立足点上培养细胞并附加生长因子来构建再生组织的尝试仍在进行中。在组织工程学中,为了在形态上重建内脏器官或组织,作为细胞增殖之立足点,可使用聚合物等化学合成品,其亦称为“支架”(scaffold)。业已多次报导有下述方法通过将目标细胞播种于该支架上,并使其在活体外的适当环境下进行培养而增殖、分化成所需细胞,或将支架移植至意图使之再生的内脏器官或组织的缺损部位,在活体内使目标细胞增殖、分化成所需细胞,由此使细胞以三维构造增殖而使所需内脏器官再生(专利文献1、2)。然而,若无该支架,使细胞以三维构造增殖便极为困难。此外,使用通过化学合成制得的支架,即使能够模拟活体原本所具备之三维构造,也仍会有无法重现内脏器官或组织的缺点。现况在于即便使用支架来构建生物人工内脏器官,仍不能充分发挥内脏器官之功能,或无论有无支架,都难以构建生物人工内脏器官本身。胚胎干细胞(embryonic stem cell,以下亦仅称为“ES细胞”)是诱导自被称为“胚泡”(blastocyst)之初期胚的未分化细胞,为具有自我复制能力与分化的全能性的细胞。ES细胞能够仅通过作为活体外(in vitro)的集合块培养而分化成包括生殖细胞在内的各种细胞。当将ES细胞分化成细胞疗法等再生医疗中所必需之功能性细胞时,首先必须形成具有三维构造的胚体。作为用以使胚体形成的ES细胞培养方法,可例举悬滴法(非专利文献1)、悬浮培养(suspension culture)、采用含甲基纤维素的半固体培养基的培养及它们的组合等方法。近年来,慢性肾功能不全(慢性肾衰竭,chronic kidney failure)的患者数量与日俱增。慢性肾功能不全是由某原因而产生肾脏疾病或除肾脏外器官疾病的肾脏障碍所发展的病状,其会使正常肾脏所具有的除去血液中所含的尿毒素的功能、内分泌功能、调节功能等功能丧失。若慢性肾功能不全恶化,则由于正常肾脏的功能丧失,因此对体内的各内脏器官便会产生影响而形成尿毒症。具体而言会形成中枢神经障碍、周围神经障碍、心/心血管障碍、消化系统障碍、视力/眼睛障碍、血液凝固障碍、免疫障碍、内分泌障碍、皮肤疾病、骨/关节障碍、电解质障碍、酸碱平衡障碍等。慢性肾功能不全是进行性的(progressive),而且无法治愈。因此,在治疗上主要着眼于延缓肾脏功能丧失速度的保守性治疗,而最终仍4需要人工透析或肾脏移植等用于替代肾脏功能的治疗(例如专利文献3)。然而,由于可提供之肾脏数目绝对不足,肾脏移植难以实施。人工透析主要分为血液透析与腹膜透析两种,血液透析虽可除去血液中的尿毒素,却无法进行作为替代内分泌功能、调节功能等之治疗。而且,血液透析每周须进行三次左右,对患者而言负担甚大。腹膜透析由于可进行自我管理而使得患者能够减少问诊次数,但会产生例如患者容易发生代谢失调或对腹膜的负担变大等问题。关于肾脏,已公开有从大鼠肾脏分离具有高增殖能力的肾脏干细胞/前体细胞(precursor cell),并由此取得细胞株确立(established)的 rKS(Rat Kidney Stem cellline) 56细胞株(专利文献4)。专利文献4中公开rKS56细胞株具有自我增殖能力;及在含有支持细胞(饲养细胞,feeder cell)培养液的体系中培养时,检测出血管内皮细胞标记(marker)而表明有分化成血管内皮细胞的可能性。亦公开其可分化成亨利氏环降支(descending limb of loop of Henle)细胞、近曲小管(proximal convoluted tubule,PCT)细胞、集尿管(collecting duct,⑶)细胞。然而,关于rKS56细胞,未曾有报导以不含支持细胞(饲养细胞)的体系使之分化的方法。此外,亦未有采用上述所分化之细胞来制造由三维构造构成的生物人工内脏器官的报导。此外,专利文献4 (特开2004-275079号公报)的公开内容以参照的方式并入本文。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2008-049146号公报专利文献2 日本特开2009-039401号公报专利文献3 日本特开平6-142193号公报专利文献4 日本特开2004-275079号公报非专利文献非专利文献1 J. Cell Biol. 126(3),701-711(1994)
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法,以及包含所得的组织细胞的生物人工内脏器官。另一目的在于提供一种包含所制造的生物人工内脏器官的医疗用材料。解决问题的方式本案专利技术人为解决上述问题而进行了深入的研究,结果发现通过在基本培养基含有胎牛血清、肝细胞生长因子、神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨形成因子7及上皮细胞生长因子的培养液中,在三维支架的存在下对干细胞进行培养,可使该干细胞分化成组织细胞,本专利技术由此得以完成。S卩,本专利技术涉及一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法,上述分化诱导方法的特征为于基本培养基含有肝细胞生长因子(HGF)、神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、骨形成因子7(BMP7)及上皮细胞生长因子(EGF)的培养液中,在三维支架的存在下对干细胞进行三维培养。此处,在本专利技术的分化诱导方法的一实施方式中,三维培养优选包含第一步骤,在含有HGF、GDNF及b-FGF的培养液中对上述干细胞进行培养;与第二步骤,从第一步骤的培养开始经过0 10天后,在含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行培养。此外,在本专利技术之分化诱导方法的一实施方式中,优选地在培养液中的HGF、GDNF、b-FGF及BMP7的浓度各独立选自100 500ng/ml、且EGF浓度选自300 700ng/ml的条件下进行培养。此外,在本专利技术之分化诱导方法的一实施方式中,优选在培养液中进一步含有血清。此外,本专利技术之分化诱导方法的干细胞优选为肾脏干细胞。本专利技术的分化诱导方法的一实施方式是包括以下步骤的分化诱导方法1)由所述干细胞形成三维细胞块的步骤;以及2)于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中,在所述三维支架的存在下对上述细胞块进行三维培养的步骤。此处,上述步骤幻可含有第一步骤(步骤2A),在三维支架的存在下于含有HGF、GDNF、b-FGF的培养液中对上述细胞块进行三维培养;与第二步骤(步骤2B),从第一步骤的培养开始经过0 10天后,于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行三维培养。此外,在上述步骤1)中,上述细胞块优选以悬滴法来形成。此外,根据本专利技术之另一本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:喜多村真治槙野博史
申请(专利权)人:株式会社器官再生工学
类型:发明
国别省市:

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