本发明专利技术发现耐辐射异球菌Deinococcus?radiodurans?R1中的dap基因(DRB0118)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本发明专利技术构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，dap基因(DRB0118)在原核宿主细胞和烟草中表达后，均能提高其耐盐抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及耐辐射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) dap基因 (DRB0118, GeneID :1799871)的新功能，具体涉及该基因在提高植物对盐胁迫抗性方面的应用。
技术介绍
耐辐射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂及渗透胁迫等极强抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物耐盐的模式物种(Battista et al.，2001)。来源于D. radiodurans Rl 基因组中一个大质粒，其编码的蛋白与渗透胁迫抗性相关。但目前未见耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans Rl中的dap基因(DRB0118， GeneID :1799871)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。本专利技术通过如下研究发现，Deinococcusradiodurans Rl 的 dap 基因(DRB0118) 具有耐高渗和盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物1、获得含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)的重组工程菌株1)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)，基因序列号为GeneID 1799871。其大小为1014bp，该基因含337个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整dap基因的重组质粒pGEMT-dap ；2)将dap基因(DRB0118)连接于pRA拟3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整dap基因 (DRB0118)重组质粒 pRA拟3-dap G ；3)将导入dap基因(DRB0118)的重组质粒pRA拟3_dap G转入受体大肠杆菌JM109 中，获得工程菌株JM-dap (见实施例1)；2、含有D. radiodurans Rl dap基因工程菌株的耐盐实验实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118) 的JM-dap重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM43菌株(见实施例2及图 4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力；此实验表明D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)具有提高原核生物耐盐的能力。3、dap基因(DRB0118)在烟草中表达及转基因植株的耐盐性鉴定1)将D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有dap基因(DRB0118)的重组质粒pBI121_dap ；2)将pBI121-dap重组质粒转化烟草中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因烟草植株；此实验表明D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3)。附图说明图1是含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)序列的PCR产物的验证电泳图■；並 1曰；图2是含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D. radiodurans Rldap基因 (DRB0118)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rldap基因(DRB01W)表达载体的大肠杆菌重组菌株；图4是含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)表达载体的大肠杆菌重组菌株。图 5 是在 250mmol. Γ1 的 NaCl 培养基上转 D. radiodurans Rldap 基因(DRB0118) 烟草与非转基因烟草的耐盐试验结果比较。图中，左边是非转基因烟草，右边是转入 D. radiodurans Rldap 基因的烟草。具体实施方式以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本专利技术作进一步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下克隆载体pGEMT-easy 为ftOmrga公司市售产品；穿梭质粒pRA拟3 为本实验室保存；植物表达载体pBI121 为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存实施例ID. radiodurans Rldap基因(DRB0118)序列在大肠杆菌中的表达根据已公布的D. radiodurans Rl基因组中的dap基因(DRB0118)序列设计1对 PCR特异性引物，从D. radioduransRl基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列Up 5' ATTAACTAGT GAGACAGTTGTCCACGCCTG 3'；Down 5' ACGCCATATG TTACAGGCTGAGAATACTGC 3'。通过PCR方法从D. radioduransRl的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件 940C IOmin, 30 个循环，72°C 10min，PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-dap，并测序验证；然后通过Spel/Ndel双酶切获得含有粘性末端的及含有启动子groEL的pRA拟3载体，将dap基因(DRB0118)连接于 PRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRA拟3-dapG，将该表达载体转化大肠杆菌JM109， 经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该重组菌株命名为JM-dap。将含有pRADZ3空质粒的E. coli JMl09命名为JM43。实施例2含D. radiodurans Rldap基因(DRB0118)重组菌株的耐盐实验一、实验方法1、将实施例1中获得的2个重组大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含 Amp抗生素)中，摇瓶过夜(37°C)培养后，再分别转接于IOOmL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至0D_ - 0. 5即可。2、取IOmL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液里冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10_4，取10 μ L点在L本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张维，江世杰，王劲，陈明，滕超，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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