人源糖基化改造的汉逊酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种人源糖基化改造的汉逊酵母。本发明专利技术提供了将重组质粒甲和乙导入汉逊酵母得到的重组菌。重组质粒甲包括：UGnT基因的表达盒、MMN9基因和GnTI基因的表达盒、MNN2基因和GnTII基因的表达盒；UGnT基因如序列1第548至1535位所示；MMN9基因如序列1第2438至2551位所示；GnTI基因如序列1第2558至3781位所示；MNN2基因如序列1第4685至4825位所示；GnTII基因如序列1第4832至5899位所示。重组质粒乙包括：MNN2基因和GnTII基因的表达盒、UGT基因的表达盒和UGalE基因的表达盒；UGalE基因如序列2第1164至2231位所示；UGT基因如序列2第3601至4659位所示。本发明专利技术提供的重组菌对制备人源糖基化蛋白具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人源糖基化改造的汉逊酵母。
技术介绍
越来越多的医用疫苗、治疗性蛋白、多肽等可以通过基因重组技术生产，并在临床治疗中发挥着重要作用。其中糖蛋白类药物是基因工程药物发展的主体，其需求不断地迅速增长。糖蛋白中蛋白是生理功能的主要承担者，糖链则对蛋白的功能起到修饰作用。许多蛋白质功能的实现都与糖基化修饰密切相关。糖链可以改变蛋白质的构象，从而导致蛋白功能发生改变。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程。至今，哺乳动物细胞是唯一能生产类似于人的复杂型糖基修饰的糖蛋白药物表达系统，但该表达系统成本高，难以放大，严重制约了治疗性糖蛋白药物产业的发展。酵母作为最简单的真核生物，虽然具有培养成本低，可高密度发酵和易于大规模生产等优点，但它合成的糖蛋白糖基是高甘露糖型结构，这种糖基结构在体内存在易被清除、高免疫原性等问题，一般不能作为治疗药物。另外真核生物产生的天然糖蛋白广泛存在不均一性，即在一种给定的蛋白质的同一糖基化位点的聚糖结构有一定范围的变化，甚至这种不均一性程度在不同的位点、不同的蛋白和不同的细胞之间也有相当大的差异。为确保药品的药效、安全性和均一性，重组糖蛋白的糖基化形式也是很重要的。糖蛋白上的糖链从连接方式上可分为两类一类是与天冬氨酸(Asn)残基连接， 即N-连接糖蛋白；另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。由于N-糖链位点保守、功能重要，糖基工程的研究目前主要集中在这N糖链上。N-糖基化修饰指包含N-乙酰葡萄糖胺残基的糖链与多肽中的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺氮相连接，糖链的主要组分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。糖基化修饰主要在内质网腔与翻译同时进行，并在高尔基体中继续反应成N-糖基化蛋白。真核细胞中各种N-糖基化加工都起始于内质网，几乎所有的生物在内质网形成的糖基化过程都是保守的。其糖链通常都会有一个五糖核心Man3GlcNAc2,具有相同的生物合成起源，即高甘露糖聚合前体Man5_9GlcNAc2。该前体并非直接在蛋白质上合成出来的，而是在脂质载体多萜醇(Dol)上合成寡糖链后转运到蛋白质受体上。进一步的糖基化发生在高尔基体，不同真核生物产生不同的糖链结构。在哺乳动物细胞，甘露糖苷酶I(a l，2mann0SidaSeI，MnsI)切除多余的甘露糖残基形成 Man5GlcNAc2 ;再有 N-乙酰葡糖胺转移酶 I ( β-I, 2-N_acetylglucosaminyltran sferasel, GlcNAcTI)在 α-I, 3_ 臂添加 GlcNAc。由甘露糖昔酶 II/III (mannosidasell/ III，MnsII/III)切除a -1,3-Man和a -1,6-Man分支，由N-乙酰葡糖胺转移酶 II-VI (N-acetylglucosaminyl transferase II-VI, GlcNAcTII-VI)继续添加 GlcNAc 形成二天线型或多天线型结构；最后由岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)、半乳糖基转移酶(galactosyltrnsferase, GalT)、唾液酸转移酶(sialytransferase, ST)添加岩藻糖、半乳糖、和唾液酸形成完整的复杂型N-聚糖。上述各酶依次定位于高尔基体膜上，糖蛋白在从高尔基体运送和向外分泌的过程中逐步被修饰(Helenius 2001)。然而，在酵母中却发生了一系列由甘露糖转移酶(mannosyltransferase, MnT)催化的高甘露糖基化反应形成含有9-200个甘露糖残基的高甘露糖结构。常见的工程酵母中都存在不同程度的高甘露糖基化并且不同的酵母形成的糖链组成和结构也不尽相同。虽然毕赤酵母酵母获得巨大成功，但在汉逊酵母的人源糖基化改造尚未见有成功的案例。多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是当前国际上公认的理想外源基因表达系统(Gellissen 2000 ；Gellissen,Kunze et al. 2005)。汉逊酵母最适生长温度高(37 43°C )，生长速率快，利于大规模发酵生产，易于培养，能够在廉价培养基中高密度培养。多形汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需基因。而且具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高等优点，是一个已得到广泛关注的外源基因表达系统。另外，与酿酒酵母相比，多形汉逊酵母在表达糖蛋白方面具有显著优势，其连接的糖链长度与酿酒酵母(20-100)和毕赤酵母￠-15)相比要短，成份构成相对简单(Cid, Gomis et al. 2000 ；Kim, Kim et al. 2006);其次，酶解分析表明夕卜链甘露糖的连接方式主要以α-1-2和α-1-6形式存在，除了前期形成的基本M3糖链形式外，几乎没有α -1-3连接的甘露糖末端产物出现(0h，Park et al. 2008 ；Song, Qian et al. 2010)。因此我们采用另一方法进行汉逊酵母的糖基化改造，避免了甘露糖苷酶的引入。 我们在原始菌株中过表达反转酶基因(Rftl)的基础上，敲出汉逊酵母N-糖基化代谢途径相关基因ALG3、ALGll基因，而不必引入相应的甘露糖转移酶基因，直接获得获得五糖核心Man3GlcNAc2前体(Song, Qian et al. 2010)。由此又筛选有效的N-乙酰葡糖胺转移酶(N-acetylglucosaminyl transferase, GlcNAcT)转入得到的 ALG3 和 ALGll 双缺陷菌株中得到菌株H. PGNT，此步得到菌株所表达的糖蛋白带有较为均一的GlCNAC2Man3GlCNAC2。 在本申请中，我们又筛选了合适的半乳糖基转移酶(galactosyltrnsferase, GalT),并按照汉逊酵母密码子优化了部分基因序列。然后，构建了 I组巧妙的质粒组合，通过筛选标记转入H. pGNT菌株中，得到了 I株基因工程菌株H. pGAL，这株酵母菌表达的糖蛋白带有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 形式的糖链。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供人源糖基化改造的汉逊酵母。本专利技术提供了重组质粒甲，包括如下功能兀件UGnT基因的表达盒、MMN9基因和 GnTI基因的表达盒、MNN2基因和GnTII基因的表达盒；所述UGnT基因如序列表的序列I自 5’末端第548至1535位核苷酸所示；所述MMN9基因如序列表的序列I自5’末端第2438 至2551位核苷酸所示；所述GnTI基因如序列表的序列I自5’末端第2558至3781位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列I自5’末端第4685至4825位核苷酸所示；所述 GnTII基因如序列表的序列I自5’末端第4832至5899位核苷酸所示。所述UGnT基因的表达盒中，可由序列表的序列I自5’末端第7至541位核苷酸所示的GAP启动子启动所述UGnT基因的表达，可由序列表的序列I自5’末端第1559至1896 位核苷酸所示的A0X1TT终止序列终止所述UGnT基因的表达。5所述MMN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邱并生，王辉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：