一种MicroRNA特异表达谱及其应用制造技术

本发明专利技术属生物学和医学检验领域，涉及一种MicroRNA特异表达谱及其临床应用。本发明专利技术提供的5个miRNAs或综合指标可判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发，准确率达77％；同时，其不但可以判断整个病例群体的肿瘤复发和预后情况，对于根据Milan分层后的病人，所述的5个miRNAs或综合指标亦可分别判断肿瘤复发和预后情况；因此，本发明专利技术可用于临床肝癌肝移植术后肿瘤高复发危险病人的筛选，帮助判断预后，早期诊断复发，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物学和医学检验领域，涉及ー种肿瘤生物标志物及其临床应用，具体涉及ー种MicroRNA特异表达谱及其应用，所述的MicroRNA特异表达谱与肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断和预后判断相关。
技术介绍
自2004年来，随着对肿瘤分子标志物研究的不断进展，microRNA成为当今分子标志物研究的热点。现有技术公开了 MicroRNAs (miRNAs)是ー种约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA (双链)但是与siRNA密切相关。据推測，这些非编码小分子RNA (miRNAs) 參与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。有越来越多的证据表明，miRNAs在肿瘤的诊断，肿瘤生物学行为以及预后的判断方面有着巨大的应用潜力。生物芯片技术是通过微缩技木，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对細胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测；它的出现给生命科学、医学、化学、新药研发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。按照芯片上固化的生物材料的不同，可将生物芯片划分成为基因芯片、蛋白质芯片、細胞芯片和组织芯片。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的 “微阵列(microarray) ”，也被称为基因芯片(genechip)多DNA芯片(DNAchip)。microRNA芯片随着研究者对miRNAs的研究的不断深入，而逐渐成为对miRNAs研究的有力的辅助工具。丹麦Exiqon公司基于LNA 专利技木，开发出一系列microRNA研究工具，其基于LNA 专利技术捕获探针的microRNA芯片，具有高灵敏度，搞特异性，Tm值均一化，杂交温度高，统ー标记方法，节约样品用量，无需纯化样品等特性，是microRNA高通量研究的有力辅助工具。目前临床上常常无法做到对肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗，往往会延误治疗的最佳时机。据统计，原发性肝癌在我国恶性肿瘤发病率中排第5位，占恶性肿瘤死亡原因的第3位。肝切除曾经是治疗肝癌的主要方法，但是在我国肝癌患者中80%以上的患者有不同程度的肝硬化，而在这些患者中能够行肝切除治疗的患者仅占10% -15%。其余的患者由于肿瘤的大小，位置以及潜在肝硬化的严重程度等因素而无法实行肝切除木。随着近年来肝移植术的不断发展和成熟，以及在国际公认肝移植标准的筛选下，肝移植术已经成为肝癌的一种有效的治疗方法。但是肿瘤的复发是影响受者长期存活的主要因素。目前在国际上常用的肝癌肝移植受者选择标准主要包括米兰标准和UCSF标准。Mazzaferro 等在1996年首次提出米兰标准①单ー癌灶直径く 5cm ；②癌灶< 3个，每个直径く 3cm ；③ 无肝内大血管浸润和肝外转移。符合米兰标准的肝癌受者肝移植术后4年生存率为85%，不符合米兰标准者肝移植术后4年生存率为50% ο 2001年，Yao等提出了 UCSF (University of California, San Froncisco)标准①单ー癌灶直径< 6. 5cm ；②癌灶< 3个，每个直径 く 4. 5cm,累计直径彡8cm ；③无肝内大血管浸润和肝外转移。符合UCSF标准的肝癌受者肝移植术后1年、5年生存率分别为90%、75%，不符UCSF标准者肝移植术后1年生存率为 50%。但是为什么在这些肝移植准入标准的严格筛选下，仍有一定比例的病人术后肿瘤复发，我们不得而知。纵观目前主要的肝癌肝移植准入标准，都着重于肿瘤大体形态学指标， 很少涉及基因及蛋白分子等实验室检查指标，不可避免地使得对于肿瘤生物学行为的评估及预后的预测片面化。所以，探讨肝癌复发转移相关的分子机制、寻找预警复发转移的靶分子，可为临床防治肝癌移植术后复发转移提供理论依据，具有现实的社会需求和重要的科学意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供涉及ー种肿瘤生物标志物及其临床应用，具体涉及ー种 MicroRNA特异表达谱及其应用，所述的MicroRNA特异表达谱是高敏感度、高特异性的新的肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断及预后判断相关的ー组特异性MicroRNA表达谱，能为肝癌肝移植术后肿瘤复发的早期诊断及预后判断提供參考依据。本专利技术采用Exiqon公司microRNA microarray筛选出肝癌肝移植术后肿瘤复发病人与肿瘤为复发病人间的miRNAs的差异表达谱，并联合应用Taqman real-time PCR方法验证芯片结果，最后扩大样本量验证由芯片获得的miRNAs的差异表达谱。本专利技术中，所述的具有差异表达的肝癌肝移植术后肿瘤复发相关的microRNAs，包括以下的ー组 5 种 miRNAs,分别为 hsa-mir_19a、hsa-mir—24、hsa-mir—223、has-mir—126、 has-mir-886-5p ；所述的一組miRNAs可较准确区分肝癌肝移植术后肿瘤复发的样品和肿瘤未复发的样品，并可准确判断病人的预后。本专利技术还提供所述的MicroRNA特异表达谱參数組合，可用于判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发及病人的预后。本专利技术中，确定所述的MicroRNA特异表达谱包括以下步骤(1)标本准备肝癌肝移植术后离体的肝脏肿瘤石蜡包埋标本；RNA 抽提试剂 trizol (Invitrogen)抽提 RNA，_80°C备用；(2)microRNA microarray 分析差异表达的 miRNAs采用丹麦Exiqon公司microRNA microarray芯片分析肝癌肝移植术后肿瘤复发标本和肿瘤未复发标本间差异表达的miRNAs ；采用miRCURYTMArray Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3 或Hy5 荧光基团标记 miRNA，得到用干与芯片杂交的荧光探针；在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY 芯片杂交；使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光強度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算；(3) Taqman real-time PCR方面验证芯片结果并扩大样本量进ー步验证差异表达 miRNAs。上述的5个差异表达的miRNAs，经过SPSS统计学分析，结合临床随访资料，结果表明，上述一組5个miRNAs可作为ー个综合的指标作为判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发并判断病人预后的參考指标。本专利技术的实施例中，采用提供的5个miRNAs或综合指标作为肝癌肝移植术后肿瘤的复发判断的參考，结果表明，參考准确率达77% ；同时，对于根据Milan 分层后的病人亦可分别作为判断肿瘤复发和预后情况判断的參考；因此，本专利技术的差异表达的miRNAs可用于临床肝癌肝移植术后肿瘤高复发危险病人的筛选參考标准，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。本专利技术为肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭志海，韩中博，樊军卫，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：