本发明专利技术公开一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，步骤为：（1）发酵菌种的准备；（2）培养基和流加培养液的制备；（3）发酵：在发酵罐中填充培养基，当温度为25℃-35℃后，按照1:100的接种比例接种100ml的吸光度A600为1-2的大肠杆菌菌种到10L发酵罐中，同时加入四环素，进行发酵，发酵进行到60-90小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵。采用本发明专利技术的发酵工艺，可高效从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达制备治疗性抗体分子，有效降低治疗性抗体的生产成本，具有独特的创新性，其产品可以满足医药，科研和临床诊断对相关人源化抗体产品的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质医药生物工程与
，具体涉及ー种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵エ艺。
技术介绍
单克隆抗体(抗体类)药物靶向性強，副作用低，疗效显著，目前广泛用于肿瘤、类风湿性关节炎等疾病的治疗，并产生了巨大的社会和经济效益。在2011年，全球抗体类药物销售额突破400亿美元。在销售额排名前10位的生物技术药物中，抗体药物共6个，且前5个药物均为治疗性抗体。单克隆抗体从最初的鼠源性单抗历经嵌合单抗、人源化单抗， 目前已经发展到全人源单抗和全人源抗体片段阶段。全人源单抗因其不含有鼠源性成分， 在临床应用上安全性更高、疗效显著，受到国内外单克隆抗体研制単位的高度重视。目前全球已经批准20个以上的全人源单抗，有100多种正在进行临床研究，全人源单抗成为治疗用单克隆抗体研究开发的主流和热点。在中国，抗体药物产业发展相对落后，主要表现为原创性抗体药物品种不足和哺乳动物细胞大规模培养核心技术如细胞密度、抗体表达量等总体水平落后。限制中国治疗性抗体产业发展的主要问题为1)基础研究起点低治疗性抗体研发力量薄弱，少有具有自主知识产权的候选抗体，尤其是在抗体筛选的技术平台方面没有自主创新；2)哺乳动物细胞培养技术/基础差大量生产抗体的动物细胞大規模培养技术仍然处发展阶段。人们目前解决这些问题的方法集中在研发哺乳细胞大規模エ业培养技术(设备和过程エ艺)。但是，或许是仰慕于世界范围内15年来人源化单克隆全分子抗体的巨大成功， 人们过多的关注在动物细胞培养表达的全分子单克隆抗体。但是世界治疗性抗体技术在本世纪的飞速发展为中国解决在中国发展治疗性抗体产业提供了另ー个切实可行的新方法和机遇，这就是治疗性抗体片段分子药物的开发。人源化抗体可变区片段的优点是(I)它是较小的抗体有效结合部位(VL和VH)， 分子量只有全抗体分子的1/5 - 1/10; (2)可以有效地在大肠杆菌、酵母菌、哺乳细胞等多个表达体系内进行较高水平和高质量的可溶性表达；(3)由于其分子小，它的稳定性优于全分子抗体，这个特性可以简化生产过程的下游纯化；(4)由于其分子小，它可以发展多种剂型，比如注射剂、吸入剂、ロ服剂等，同时它还可以进入组织和细胞内部作用与细胞内的靶点，应用范围广；(5)由于其分子量小，它的单位重量分子数是全分子抗体的5-10倍，因此单位剂量的抗体起作用效能远高于全分子抗体，进而显著降低用药成本；(6)由于其分子量小，可以发展同时作用于两个靶点的双功能的治疗性抗体，全分子抗体相对难以完成这个任务；(7)由于其分子量小，可以采用多种可能的延长半衰期的技术方法并不增加表达的技术难度，等等。目前，在世界范围内，研究人员对大肠杆菌发酵制备治疗性抗体或抗体片段ェ艺有广泛的尝试，但在治疗性抗体或抗体片段的生产效率的提高上遇到诸多困难。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，能够高效地从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达治疗性抗体或抗体片段。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，包括如下步骤(1)发酵菌种的准备在新鲜配制的含有IO-IOOmM四环素的卢波平板上均匀涂布大肠杆菌菌液，在37°C培养16小时，挑取分散良好的大肠杆菌菌株，转移至含有IO-IOOmM四环素的卢波培养基中，在37°C摇床培养16小时，最后将上述卢波培养基按I :10-1 :1000的接种比例接种到IOOmf IOOOml的卢波培养基中，在37°C摇床培养8小时；(2)培养基和流加培养液的制备培养基的制备将酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾 10_50g、抗生素I μ g-lmg、消泡剂100-500 μ mol,均勻混合,加入O. 6L的水，室温下搅拌 30min至液体澄清，然后加入甘油10-90g，室温搅拌lOmin，待混合均匀，继续加入水为IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸调整pH至6-8，在100-120°C高压灭菌20分钟；流加培养液的制备将酵母菌提取物50-100g、硫酸铵IO-IOOg,均匀混合，加入0. 6L 水,室温下搅拌30分钟至液体澄清，然后加入甘油400-800g,室温搅拌10分钟，待混合均匀，补水至1L，在100-120°C高压灭菌20分钟。(3)发酵在发酵罐中填充培养基，当温度为25_35°C后，按照1:100的接种比例接种IOOml的吸光度八_为1-2的大肠杆菌菌种到10L发酵罐中，同时加入四环素，发酵参数设定为温度 T=25-37°C，酸碱度 ρΗ=6· 0-7. 5，转速 S=500rpm-1400rpm，通气量为 V=l_5vvm， 发酵12-15h后，发酵液中溶氧(DOT)出现显著波动时，开始流加培养液，流速为50-200ml/ h，发酵到16 20小时后加入诱导素；调整发酵温度至T=20-25°C，流加速度调整为25_50ml/ ho发酵进行到60-90小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的培养基的组成为酵母提取物35-55g、蛋白胨 25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾10-50g、抗生素、消泡剂100-500 μ mol、甘油10_90g、 水 0.9-1L。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的流加培养液的制备是酵母菌提取物50-100g、 硫酸铵 IO-IOOg,甘油 400-800g、水 0. 6-1L。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的抗生素为四环素、卡那霉素或羧苄青霉素中的一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的治疗性抗体或抗体片段是指功能基团抗体、片段抗体、单链抗体或纳米抗体中的一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的治疗性抗体是单链抗体中的一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述的大肠杆菌是指肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。本专利技术的有益效果是本专利技术提供了培养基和流加培养液能充分满足大肠杆菌在发酵过程中的营养要求，而且有效控制了发酵过程中的关键参数，采用本专利技术的发酵工艺， 可高效从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达制备治疗性抗体分子，有效降低治疗性抗体的生产成本，具有独特的创新性，其产品可以满足医药，科研和临床诊断对相关人源化抗体产品的需求。附图说明图I是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的治疗性单链治疗性抗体的电泳图，I、蛋白质分子量marker ;2、诱导前上清液#I ;3、诱导前上清#2 ;4、诱导前上清#3 ;5、发酵上清液；6、发酵胞质空间组分I ;7、发酵胞质空间组分II ;8、1.0 8/1标准品；9、1.0 g/L标准品； 10、1.0 g/L 标准品；图2是诱导前发酵上清液和诱导后发酵上清液的免疫印迹检测的检测结果图3是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的片段抗体电泳图，M、蛋白质分子量marker ;1、 诱导后上清液；2、诱导前上清液；3、52kD片段抗体纯化结果；图4是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的功能基团抗体电泳图，M、蛋白质分子量 marker ;1、诱导前菌体总蛋白；2、诱导后菌体总蛋白；3、总蛋白过层析柱后流出样品。4-12 纯化19kD功能基团抗体；图5是SDS-PAGE法检测发酵反应生成本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龙泉，杨艳坤，张芃芃，杨冬，刘冰，
申请(专利权)人：拜明苏州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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