本发明专利技术涉及基因工程领域，提供了一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒，该方法包括以下步骤：A.利用G6PD基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，并基于扩增产物构建测序文库；B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。该方法及其相应的试剂盒利用高通量测序技术对多个目标区域同时进行区域测序，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行多区域检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒。
技术介绍
6 憐酸葡萄糖脱氧酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)基因位于染色体Xq28区域，由13个外显子及12个内含子组成，全长20Kb，是典型的看家基因。目前， 全世界已经发现的突变类型超过140种，我国已发现至少30种。G6H)基因突变具有以下特点多为单个碱基置换的错义突变；大多数基因突变属于转化型突变，常发生在cpg 二核苷酸内的c-t的转换；具有种族和地区异质性；尚未发现整个基因或大片段基因的缺失，也未见无义突变及移码突变；除外显子I外，基因突变遍及其余外显子；具有复合突变。Gero是细胞内单磷酸己糖分解代谢过程中所必需，它能催化单磷酸己糖脱氢产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADPH),后者在 NADPH 氧化酶的作用下产生H202，从而在细胞内发挥杀菌作用。因此，对G6H)基因进行测序，确定该样本中的G6H) 基因的序列，具有重要的意义。目前，对G6H)基因进行测序的常见方法为Sanger测序法，通过Sanger测序法能够对目标区域进行区域检测，但是Sanger测序法每次只能对一个样品的G6H)基因的某一段区域(不大于900bp)进行测序，检测效率低，测序成本高，且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品的信号时会出现双峰乃至多峰，导致测序所得的测序峰图紊乱，甚至无法分析得到的序列信息，测序失败。大量的研究已经证实，PCR产物直接测序法仅能于混合模板中检测出比例> 20%的模板，且无法得出发生突变位点的精确变异比例。而现有技术中基于Sanger测序法的试剂盒存在同样的缺陷。因此，需要一种检测6磷酸葡萄糖脱氢酶基因的新方法和新试剂盒，能够同时对 G6PD基因的多个区域进行区域检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒，能同时对Gero基因的多个目标区域进行区域检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并还能进一步同时对大量样品进行检测。本专利技术是这样实现的，一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法，包括以下步骤A.利用Gero基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，并基于扩增产物构建测序文库；B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。其中，所述步骤A包括以下步骤toon] Al.利用Gero基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到与所述多个目标区域对应的扩增产物；A2.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。其中，步骤A2包括以下步骤A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得到片段化产物；A22.利用接头元件，与片段化产物进行连接，构建测序文库。步骤A所述的目标区域测序文库的长度无特殊限制，优选为25bp 500bp。更优选为50bp 200bp,更优选为70bp 130bp。其中，所述步骤A22包括以下步骤A221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；A222.环化第一连接产物，得环化产物；A223. II s型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物； A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。其中，所述步骤A22包括以下步骤Α22Γ .利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；A222’ . II s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得带有第四接头的酶切片段；A223’ .带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。其中，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。该第一标签序列，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限。进一步的，该第一标签序列碱基数为3 20，更优选为4 10。其中，步骤A所述的特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。进一步的，每个目标区域对应的特异性引物中，至少一条引物与该目标区域部分互补，该部分互补的引物的5’端包含有第二标签序列。该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。该第二标签序列，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限。进一步的，该第二标签序列碱基数为3 20，更优选为4 10。其中，所述步骤A中同一样品的G6ro基因的各目标区域的扩增，同时进行或部分同时进行或分别独立进行。其中，所述步骤A中的G6H)基因特异性引物包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :24， 以及 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO :20 和 SEQ ID NO :22 中的至少一条，SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :23 中的至少一条。其中，步骤B所述的单分子扩增的方法为乳液PCR、桥式PCR中的至少一种。其中，步骤C所述的高通量测序技术为基于聚合酶的合成测序法或基于连接酶的连接测序法。本专利技术的还提供了一种能够用于本专利技术的任一种测序方法的试剂盒，本专利技术是这样实现的，一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的试剂盒，包括Loose] Gero基因特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增；接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库。其中，所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。其中，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。该第一标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第一标签序列的碱基数优选为3 20。其中，所述Gero基因特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。进一步的，每个目标区域对应的Gero基因特异性引物中，至少一条引物与该目标区域部分互补，该部分互补的引物的5’端包含有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。该第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第二标签的碱基数优选为3 20，更优选为4 10。其中，所述G6PD基因特异性引物包括SEQ ID NO :1和SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，
申请(专利权)人：盛司潼，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。