本发明专利技术涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。在静注人免疫球蛋白制备工艺过程中，采用辛酸及氯化钙沉淀法处理静注人免疫球蛋白制备工艺中的组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，去除组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的杂蛋白，再进行两步层析工艺。本发明专利技术与通常辛酸沉淀法相比，加入了氯化钙有效地去除了组分Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液中的各种凝血因子，同时提高了免疫球蛋白的稳定性，产品得率显著提高，可至每升血浆7克以上；采用2种不同离子交换柱及层析技术进行上柱层析纯化，能够有效地去除杂蛋白，产品纯度达到99.5%以上。此外加入辛酸及采用DV20滤芯除病毒过滤，能够显著提高去除病毒的效果，提高临床用药的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。
技术介绍
静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法或辛酸沉淀法分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。通常生产方法为低温乙醇离心(压滤)法和辛酸沉淀法，产品得率低，稳定性不好。现有的低温乙醇法静注人免疫球蛋白工艺采用低温乙醇处理组分II + III沉淀，该工艺在制备过程通过对乙醇浓度、PH值等参数控制分离出组分III沉淀，再进行一步层析工艺。该方法在分离出组分III沉淀过程中使静注人免疫球蛋白析出到III沉淀中的量较大，产品得率只能够达到每升血浆5. 5克左右，纯度只能够达到96%以上。现有的辛酸沉淀法静注人免疫球蛋白工艺利用辛酸能够沉淀大部分非免疫球类蛋白，从而达到去除杂蛋白的目的。但该方法对去除凝血因子类物质效果不是恨明显，使产品纯度受到一定的影响。产品得率只能够达到每升血浆6. 3克左右，纯度只能够达到98% 以上。为了使静注人免疫球蛋白的产品得率及纯度进一步提高，开发出一种产品生物活性、产品得率和产品纯度更高的静注人免疫球蛋白的制备工艺显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用辛酸与氯化钙沉淀法处理组分II + III沉淀，再进行两步层析工艺，产品得率可达每升血浆7克以上，产品纯度达到99. 5%以上的静注人免疫球蛋白的制备工艺。本专利技术的技术方案它采用辛酸及氯化钙沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行两步层析工艺，其制备工艺如下(1)、将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在O 4°C ;分离冷沉淀，冷沉淀用于VDI因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度控制在I 3°C之间，按不超过I. OL/min的流速加入pH 4. O醋酸缓冲液调节蛋白液PH值为6. 80 7. 00 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇，流速不超过I. 5L/ min，使乙醇体积比终浓度至8%，温度控制在一 I 一 3°C，加完乙醇后pH值为6. 80 7. 20 ；(2)、将步骤(I)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/ min/台，出液温度控制在一 I 一 3°C，离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产；(3)、将步骤⑵的制得物组分I上清蛋白液加入pH4. O醋酸缓冲液调节pH值为6.60 6. 65 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇至乙醇体积比浓度为22%，温度控制在一 4 一6°C ;搅拌120min以上后,静置60min以上,再开启搅拌,按每升反应液加入18±0. 5g娃藻土，进行压滤，进液压力最高不超过O. 20Mpa,压滤得组分II + III沉淀和组分II + III上清液， 组分II +III上清液用于人血白蛋白生产；(4)、将步骤(3)的制得物组分II+III沉淀，加入8±2°C的10 12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙，使溶解液钙离子浓度为O. 2±0. 01mol/L ;加完搅拌30±5min ;然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为 4. 5±0. 2，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98. 5%辛酸40±1毫升，加完搅拌 60±5min后进行压缩过滤，过滤压力不超过O. 2 Mpa,收集压滤液；(5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为①对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2 8°C注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3% 6%，用pH4. O醋酸缓冲液调pH至 4. O 4. 5，然后加磷酸一 NaOH缓冲液调节电导率在T=19°C时测为O. 21 s / m O. 25s / m,所述的磷酸一 NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为lmol/L,调节好后用Macrocap-Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；②将收集第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2 8°C注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3% 6%，用O. 5±0. lmol/L的NaOH调pH至6.8 7.0，然后加所述的磷酸一 NaOH缓冲液调节电导率在T=19°C时测为O. 15 s / m O.17s / m，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液；(6)、用lmol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.8 4. O,开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上，用5倍体积2 8°C注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用lmol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量 10%±1%，pH 为 3. 8 4. 4，蛋白含量 5. 5+0. 5% ；(7)、步骤(6)的制得物经0.2μπι除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24°C±1°C孵放21 天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0. 2 μ m除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加 244. 9ml质量浓度为99%冰乙酸和65. 6g乙酸钠。组分I上清液，组分I沉淀，组分II + III沉淀，组分II + III上清液为所属
的通用分类方法；在本专利技术中是也是按通用分类方法分类后物质的名称，并不是指单纯的序号。通过人血浆经离心分离冷沉淀，分离后的离心上清蛋白液通过调节pH及温度，添加乙醇再离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；通过对组分I上清蛋白液调节pH值及温度，添加乙醇再压滤得组分II +III沉淀和组分 II + III上清液；组分I沉淀主要含有纤原、FV III、Ciq、Clr、Cls、和纤维结合蛋白等；组分I上清蛋白液主要含有白蛋白、IgG、IgA、IgM、F II、VII、IX、X、a、β球蛋白、铜蓝蛋白、α I —抗胰蛋白酶、IgM、AT-III补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等；组分II +III沉淀主要含有IgG、IgA、IgM、F II、VII、IX、X、a、β球蛋白、和铜蓝蛋白等；组分II +III上清液主要含有白蛋白、a、0球蛋白、铜蓝蛋白、α I —抗胰蛋白酶、IgM、 AT-III补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等。本专利技术具有积极的意义本专利技术方法采用辛酸与氯化钙沉淀法处理组分II +III沉淀，再进行两步层析工艺。此外本专利技术方法在处理组分II +III工艺过程中，没有添加乙醇，乙醇会影响蛋白结构易造成蛋白发生变性，从而使蛋白活性降低。具体为I、采用辛酸及氯化钙沉淀法去除组分II +III沉淀中的杂蛋白及凝血因子类物质，避免传统低温乙醇法制备过程中乙醇对基于PH4的静注人免疫球蛋白分子结构活性片段的不利影响，采用辛酸及氯化钙沉淀法能够使静注人免疫球蛋白分子结构活性片段完全得到保护，提闻广品生物活性，广品质量能够得到进一步提闻。2、相比通常辛酸沉淀法，本专利技术增加了氯化钙对组分II + III沉淀溶解液进行了处理，能够显著本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁小明，邓志华，何淑琴，刘敏亮，
申请(专利权)人：江西博雅生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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