前原条和中内胚层细胞制造技术

本发明专利技术涉及包含人前原条细胞和/或人中内胚层细胞的组合物及其生产方法。此外，本发明专利技术还公开了鉴定可用于进一步分化前原条和中内胚层细胞类型的因子的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和细胞生物学领域。具体地，本专利技术涉及包含前原条和/或中内胚层细胞的组合物，以及制备、分离和使用这些细胞的方法。
技术介绍
人多能性干细胞(pluripotent stem cell),如胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)，于1994年首先从无成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Bongso et al.，1994)， 1997年从含成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Hogan, 1997)。随后Thomson、Reubinoff 和Shamblott建立了采用有丝分裂失活的小鼠饲养层连续培养人ES和EG细胞的方法 (Reubinoff et al. , 2000 ；Shamblott et al. , 1998 ；Thomson et al. ,1998)。人ES和EG细胞(hESC)为研究人类早期发育和为治疗性干预一些疾病状态(如糖尿病和帕金森氏症)提供了极难得的机会。例如，在采用细胞疗法治疗糖尿病的过程中，使用衍生自hSEC的产生胰岛素的β细胞会比目前利用来自供者胰腺的细胞治疗糖尿病有很大进步。但目前还不知道如何从hSEC得到产生胰岛素的β细胞。因此，目前利用来自供者胰腺的胰岛细胞治疗糖尿病的细胞疗法受限于缺乏移植所需的高质量胰岛细胞。对单一 I型糖尿病人的细胞治疗需要移植大约8 X IO8胰岛细胞(Shapiro et al. ,2000 ；Shapiro et al.，2001a ;Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰岛细胞至少需要两个健康供者的器官提供。而人胚胎干细胞为开发用于人类细胞治疗的大量的高质量分化细胞提供了起始材料的来源。多能性和能够维持hSEC细胞较长时间培养这两个性质使其特别适合用于细胞治疗。多能性是指hESC能够分化为所有3种主要胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，进而在除胚胎外组织(如胎盘)和生殖细胞外还形成成熟器官的所有体细胞类型的能力。尽管多能性赋予了 hSEC特殊的用途，但这个性质也给这些细胞及其衍生物的研究和控制带来挑战。由于在分化hSEC培养基中会产生大量细胞类型，所以大部分细胞类型产生效率很低。而且，成功评价任一指定细胞类型的产生关键取决于定义合适的标志物。高效、定向的分化对hESC的治疗应用非常重要。由此，除完成hESC的高效定向分化外，鉴定可以用于鉴定和/或分离特定细胞的标志物是有利的，该特定细胞处于其从hESC分化出来的最早期阶段。此外，还有利的是鉴定促进这些源自hESC的早期前体细胞向可用于细胞治疗的细胞类型分化的因子。
技术实现思路
本专利技术的实施方案涉及包含人细胞的细胞培养物。这些细胞培养物中，至少约 5%的人细胞是前原条细胞(preprimitive streak),其中该前原条细胞是可以分化为中内胚层细胞的专能细胞(multipotent cell)。其它实施方案中，培养物中至少约10%到至少约90 %的人细胞是前原条细胞。本文所述的某些实施方案中，人饲养细胞也存在于细胞培养物中。这些实施方案中，除饲养细胞外，至少约5%到至少约75%的人细胞是前原条细胞。一些实施方案中，该前原条细胞表达标志物，例如FGF8和/或核定位的β-连接素(β-catenin)。某些实施方案中，这些标志物中的一种或两种的表达高于brachyury、 FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞培养物基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞 (definitive endodermal cell)、外胚层细胞和/或中胚层细胞。关于本专利技术的某些实施方案，前原条细胞培养物包含多能性人细胞，如人胚胎干细胞(hESC)。这些实施方案中，细胞培养物中对应每I个hESC存在至少约2个到至少约 10个前原条细胞。一些实施方案中，该hESC源自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴。一些实施方案中，含有人前原条细胞的细胞培养物包含的培养基含有少于约2% (v/v) 到少于约O. 2% (v/v)的血清。优选实施方案中，该细胞培养物包含不含血清或血清替代物的培养基。其它实施方案中，含有人前原条细胞的细胞培养物包含TGFii超家族的Nodal/ 活化素(Activin)亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。本文所述的其它实施方案涉及包含中内胚层细胞的细胞培养物，其中该中内胚层细胞是可以分化为中胚层或定形内胚层细胞的专能细胞。这些实施方案中，该细胞培养物包含人细胞，其中至少约5%的人细胞是中内胚层细胞。其它实施方案中，培养物中至少约 10%到至少约90%的人细胞是中内胚层细胞。本文所述的某些实施方案中，人饲养细胞也存在于细胞培养物中。这些实施方案中，至少约5%到至少约75%的除饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。一些实施方案中，中内胚层细胞表达标志物，如brachyury、FGF4、和 /或SNAI1。某些实施方案中，这些标志物中一种或多种的表达高于0CT4、S0X17、CXCR4、 F0XA2、S0X7和/或SOXl的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞培养物基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和/或中胚层细胞。关于本专利技术的某些实施方案，中内胚层细胞培养物包含多能性人细胞，如人胚胎干细胞(hESC)。这些实施方案中，细胞培养物中对应每I个hESC存在至少约2个到至少约 10个中内胚层细胞。一些实施方案中，该hESC源自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴。一些实施方案中，含有人中内胚层细胞的细胞培养物包含的培养基含有少于约2% (v/v)到少于约O. 2% (v/v)的血清。优选实施方案中，该细胞培养物包含不含血清或血清替代物的培养基。其它实施方案中，含有人中内胚层细胞的细胞培养物包含TGFii超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。本文所述其它实施方案涉及包含特定细胞的细胞群，该特定细胞中至少约90%是人前原条细胞。这些实施方案中，该前原条细胞是可以分化为中内胚层细胞的专能细胞。 其它实施方案中，该细胞群中至少约95%到至少约98%的人细胞是前原条细胞。一些实施方案中，前原条细胞表达标志物，如FGF8和/或核定位的β-连接素。某些实施方案中，这两个标志物中一种或两种的表达高于brachyury、FGF4、SNAIU S0X17、F0XA2、S0X7和/或 SOXl的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞群基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和/或中胚层细胞。本文所述其它实施方案涉及包含特定细胞的细胞群，该特定细胞中至少约90%是人中内胚层细胞。这些实施方案中，该中内胚层细胞是可以分化为中胚层细胞和/或定形内胚层细胞的专能细胞。其它实施方案中，该细胞群中至少约95%到至少约98%的人细胞是中内胚层细胞。一些实施方案中，中内胚层细胞表达标志物，如brachyury、FGF4、和/或 SNAI1。某些实施方案中，这些标志物中一种或多种的表达高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0X本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·艾伦·达穆尔，艾伦·D·阿古尼克，苏珊·埃利泽，依文特·克鲁恩，伊曼纽尔·E·贝特格，
申请(专利权)人：维亚希特公司，
类型：发明
国别省市：