本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎硫氧还蛋白及其制备和应用。硫氧还蛋白为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：构建质粒pETrx，将其转化BL21(DE3)，获得BL21(DE3)/pETrx，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为硫氧还蛋白。所述硫氧还蛋白具有显著的还原酶活性、抗氧化作用和促细胞生长作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎硫氧还蛋白及其制备和应用。
技术介绍
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一种分子量约12 kDa的小分子还原蛋白，广泛存在于各种原核和真核生物体。硫氧还蛋白拥有一个高度保守的、具还原活性的催化位点，其结构特征为CXXC。硫氧还蛋白与各种不同的巯基蛋白作用，将其二硫键还原为双巯基。借此功能，硫氧还蛋白调控多种重要生物过程，如氧化还原状态的维持、基因表达、免疫反应等。已知高等动物的硫氧还蛋白具有多种生物学活性，包括抗氧化活性、促生长作用、 抗细胞凋亡、抗肿瘤作用等。但是鱼类硫氧还蛋白的研究很少，其作用和生物学活性皆不甚清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种硫氧还蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种硫氧还蛋白，硫氧还蛋白为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述硫氧还蛋白为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒pETrx转化大肠杆菌DH5a获得的重组蛋白。硫氧还蛋白的制备方法以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体 pBS-T连接,连接混合液转化大肠杆菌,得质粒pBSTrx ；将上述质粒pBSTrx和质粒pET259用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA 连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，得质粒pETrx ；将上述所得质粒pETrx转化BL21 (DE3)，所得转化子BL21 (DE3) /pETrx纯化所得重组蛋白，为序列表SEQ ID No. I中的氣基酸序列所不的硫氧还蛋白；所述Fl 为 5’ -GATATCATGGTTTACGAAGTGAAAG -3’ ； RI 为 5’ -GATATCTTCTTTTTCATACTGCTTC -3’。硫氧还蛋白的应用，所述序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列编码的硫氧还蛋白作为还原酶活性、抗氧化或促细胞生长的制剂。本专利技术具有如下优点本专利技术的硫氧还蛋白制备简单，具有明显的还原酶活性、抗氧化作用和促细胞生长能力。附图说明图I为本专利技术实施例提供的纯化得到的硫氧还蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的硫氧还蛋白为泳道2 ;泳道I :分子量marker。)。图2为本专利技术实施例提供的硫氧还蛋白的还原酶活性检测图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell Molecular Cloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001);酵母转化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Russell Molecular Cloning A Laboratory MannuaI. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001o3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例I本专利技术的硫氧还蛋白为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. I 为MVYEVKDYNDFTQQLKRAGNKLVVVDFTATWCQPCKNISPVFEELANQYKNVVFLKVDVDEADDVSTEC E I NCMPTFLFYRNEKRVHSFSGANSDTLRAAVKQYEKE(a)序列特征 长度107·类型氨基酸序列·链型单链·拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源半滑舌鳎结构特点该蛋白预期含有一个CXXC结构域，由氨基酸35-38构成，实施例2硫氧还蛋白的制备方法I)质粒pETrx的构建以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 48°C 60s, 72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s，30个循环后再在72°C延伸反应7-10min。PCR产物纯化后与载体pBS_T (购于 “天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5ci 后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal (40ug/ml)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml) 的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTrx。将pBSTrx和质粒 pET259(质粒 pET259 构建过程参见 Zheng, ff. J.，Hu, Y. H.，Sun, L. ,2010. Cloningand analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28,829-836)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收0. 3kb和5. 4kb片段， 将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(30ug/ml) 的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pETrx。所述LB组成成分按重量百分比计1. O %蛋白胨，O. 5 %酵母粉，I. O % 氯化钠,97. 5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -GATATCATGGTTTACGAAGTGAAAG -3’ ；R1 为 5’ -GATATCTTCTTTTTCATACTGCTTC -3’。2)硫氧还蛋白的表达和制备将步骤I)的质粒pETrx转化BL21 (DE3)(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21(DE3)/pETrx。 将BL21 (DE3)/pETrx在含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养至0D_为0. 6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到0. 4mM，30°C继续摇动培养4-5小时，而后用GE Healthcare (美国)公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件用4-5ml Wash buffer洗柱两次，随后用0. 5_lml Elution buffer洗柱,收集所有洗脱液)。将洗脱液中的重组蛋白进行质谱分析，证实其为序列表SEQ ID No. I中氨基酸序列所示的硫氧还蛋白。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，发现其分子量与表SEQ ID No. I中序列的分子量一致(参见图I)。上述Wash buffer 成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. 0 ； 上述 Eluti本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，李永鑫，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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