本发明专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用高产菌株发酵生产AD和/或ADD的方法。本发明专利技术公开了一种能够高效转化甾醇类物质生产AD和/或ADD的分歧杆菌菌株，其分类命名为Mycobacterium.sp-BK-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC?No.5707。本发明专利技术还公开了利用所述菌株转化甾醇生产AD和/或ADD的方法。本发明专利技术所述的菌株依靠现有微生物转化甾醇类物质生产AD和/或ADD的工艺可以将发酵培养基中浓度高达3.5％的甾醇类完全转化为AD和/或ADD，且转化率接近70-80％左右，从而在保证了单次转化率的基础上，加大了单次生产的数量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用高产菌株发酵生产AD和/或ADD 的方法。
技术介绍
雄留-4-烯_3· 17- 二酮(androst-4-ene_3,17-dione,简称雄烯二酮、AD)和雄留-I,-4-二烯-3. 17-二酮(androsta-l, 4-diene_3,17-dione,简称雄二烯二酮、ADD)均是重要的留类药物中间体，雄烯二酮(AD)既可作为雄性激素、促蛋白合成激素等激素类物质的前体，也可用于合成螺留内酯、氢化可的松、氧化泼尼松，地塞米松等药物；而雄二烯二酮(ADD)可用于雌性激素、口服避孕药等药物的合成。相对ADD而言，AD在医药行业的使用范围更广更深，超过90%甾体激素类药物都是以AD作为基础原料进行生产的。到目前为止，AD及ADD的制备方法主要有薯蓣皂苷元途径的化学合成法和留醇物质侧链降解的微生物转化法。由于穿地龙等薯蓣类植物日益枯竭，而且化学合成的污染大， 成本高，所以其逐步被微生物转化法所取代。现已发现，微生物中如节杆菌属、短杆菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属和分枝杆菌属能将留醇类物质降解为二氧化碳和水，同时代谢过程中伴有AD/ADD等中间产物的形成。据报道，分枝杆菌(Mycobacterium)MB3683和MB3605是比较常用AD/ADD的生产菌株，常规的生产方法是先在适当的培养基中培养菌体，然后将菌体移至含有留醇类物质的发酵罐中，经过大约120-168小时的生物转化生产AD/ADD，然后用适当的有机溶剂将AD/ADD进行萃取、分离、结晶并精制，即可得到白色的结晶粉末状的AD/ ADD。但利用留醇物质的微生物转化法中，受限于留醇类物质在水溶性的培养基中溶解度很小，导致微生物无法充分利用并将其转化，因而导致发酵周期较长，且AD/ADD的有效转化率很低。一般为了解决这一问题，通常会往培养基加入司盘(Span)、吐温(Tween)等乳化剂以改善底物的分散度，进而增加微生物与底物的接触机率以期望提高整个体系的生物转化率，但是实际效果并不明显。现有技术中，也报道了一些通过添加乙醇、甘油等有机溶剂的单相发酵系统，能够提高留醇类物质的溶解性，提高微生物的生物转化率；但是添加过多的有机溶剂对细胞有毒害作用，最终也会影响产品的得率。针对上述问题，现有技术中开发出利用如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)等聚合物与发酵液构成的双水相发酵系统提升AD/ADD的产量，该双水相发酵系统能提高留醇类物质的溶解度，而且对微生物的生长繁殖影响不大，进而提高AD/ADD的转化率，但是受限于聚合物的价格因素而阻碍其在工业领域的大规模生产及应用。此外，还有一种利用与水不相容的有机溶剂如辛醇等，与发酵液形成不相溶的双液相系统，该系统的优点是留醇类物质的溶解度和生物转化率都有比较明显的提高，而且AD/ADD几乎全部集中在有机相，分离比较容易；但缺点是溶剂对微生物的毒害作用、以及由于溶剂挥发所产生的安全问题，均不利于工业推广。中国专利CN101525651A公开了一种双液相系统中生物降解植物甾醇制备“雄烯二酮”的方法，该专利通过添加葵花油作为有机相，与水相发酵液形成油/水双液相培养系统，并利用分枝杆菌Mycobacterium sp_UV_8在此系统中繁殖并有效转化植物甾醇生产 AD，整体转化率在80%左右，但是该系统中葵花油用量至少达到20% V/V，而投料量却只有 0.6%,虽然其转化率可以达到80 %，但单次生产量仍然很低，远达不到生产要求。中国专利CN1639154A公开了一种将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法，该方法通过镰孢菌属菌株(Fusarium)利用AD合成ADD,该法首先利用分枝杆菌Mycobacterium MB3683将植物留醇的侧链降解为AD或者直接提供AD作为底物，然后利用事先培养好的镰孢菌属(Fusarium)培养物移入上述含有AD的发酵液中进行生物转化，并最终获得所需的 ADD，随后将其分离并纯化即可。该法虽然可以获得高纯度ADD，但是整个体系的留醇投料量只有I. 0%，且两阶段培养周期耗时高达95 136h之间，而AD转化为ADD的转化率只有 25-40%，这也就意味着若由留醇直接转化为ADD的转化率只有20-30%，不仅转化率很低； 而且所获得ADD晶体中含有约5%左右的AD，需要通过其他方法才能分离去除。中国专利CN101760494A公开了一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法，该专利所述的发酵方法将具有降解植物留醇得到AD/ADD的微生物菌种的静息细胞，加入到植物留醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物留醇转化得到AD/ADD 结束后，去除菌体细胞，并将转化液经溶剂提取得到AD/ADD。该方法中的底物投料量也能达到1-2%，整体转化率可以达到80%左右。该技术实质为二步培养法，首先获得菌体然后进行生物转化。该法着眼于菌丝的重复利用，缩短发酵周期，但需要不断的移出AD/ADD和更换培养液，并洗涤菌丝，操作步骤复杂，菌种容易退化并有染菌甚至是感染噬菌体的风险。上述几种发酵生产AD和/或ADD的方法的底物投料量较低的主要原因在于现有技术中的生产菌株的底物消化能力较差，导致虽然整个反应的转化率较好，但依然限制了该工艺的大规模应用。而且，上述几个专利所述的方法均采用特殊的突变株，而一般野生的分枝杆菌(Mycobacterium)生物转化留醇类物质时,产物多为AD/ADD的共混物,两者比例为4-9 1，两者的比例无法随意调整，而且并未有经济可行的分离方法将两者分离开来。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于现有技术中AD和/或ADD单次底物投料量较低的问题，进而提供一株可转化高投料量的AD和/或ADD的分歧杆菌株。 本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用所筛选的分歧杆菌株转化高投料量底物生产AD和/或ADD的方法。本专利技术所要解决的第三个技术问题在于提高一种产物中AD和ADD的比例可控制的生产方法。为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种分歧杆菌菌株，其分类命名为 Mycobacterium. sp-BK-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址中国.北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号是CGMCC No. 5707，保藏日期是2012年I月10日。本专利技术还公开了一种微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其包括使用本专利技术的菌株。示例性地，在本专利技术的方法中，将上述分歧杆菌菌株，在含有植物油和留醇类物质的适于分歧杆菌菌株生长的发酵培养中培养，将留醇类物质转化为AD和/或ADD的步骤。优选的，在本专利技术的方法中将留醇类物质完全转化为AD和/或ADD。所述方法包括在含有留醇类物质的适于分歧杆菌菌株生长的发酵培养中培养，以将甾醇类物质转化为AD和/或ADD的步骤。所述的发酵培养基还含有植物油。所述发酵培养基包括组分可为植物油15-30% V/V(即所述植物油的体积占所述发酵培养基总装液量的体积比)、留醇类物质10-50g/L、碳源30-70g/L、氮源15_50g/L、无机盐2. 5-7. 5g/L、其余为水。所述植物油可为大豆油、葵花油、菜籽油、花生油和妥尔油中的一种或几种本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林智德，王宏辉，毕锡阳，张雅娟，辜丹锋，
申请(专利权)人：广东本科生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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