本发明专利技术公开了一种云南红梨PyTTG1基因及其原核表达载体，具体涉及一种云南红梨花青素合成、根毛、叶毛和毛状体发生发育的调控蛋白PyTTG1基因及其原核表达载体，并将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTG1中，具体是利用RT-PCR技术从云南红梨果皮中克隆PyTTG1基因全长cDNA，然后再利用原核表达载体将该全长基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行表达纯化，获得云南红梨PyTTG1纯化蛋白，及云南红梨PyTTG1纯化蛋白在研究TTG1-MYB、TTG1-bHLH等互作及MYB-bHLH-WD40模型构建中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素合成调控、叶毛和毛状体发生发育的调控基因基因及其原核表达载体，以及应用原核表达载体制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTGl。
技术介绍
植物花青素的合成是由转录复合物MYB-bHLH-WD40调控的。前人对MYB和bHLH 研究较多，而对植物中的WD40蛋白研究较少。WD40蛋白含WD40基序(约40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-组氨酸(GH)开始，以色氨酸-天冬氨酸(WD)结尾)。WD40蛋白含1-10个串联的WD40基序，一般认为至少4个以上的WD40基序才能形成高级和有功能的结构。现有研究表明WD40蛋白是一个结构多样、功能各异的蛋白家族，通常它们具有两个共同特征一是结构域折叠成β_螺旋桨结构，一是形成多蛋白可逆组装但不具任何催化活性的平台，它们主要是在真核生物的蛋白质-蛋白质复合物形成中起作用。Fritzius等人发现ProF蛋白是将激酶和底物汇集在一起的适配器蛋白。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作为植物特异性发育事件如开花、花发育、分生组织形成、花粉发育和配子形成关键调节因子。WD40蛋白主要通过其WD结构域与其它蛋白互作，参与植物内众多代谢反应的调控。Morita等人在牵牛花中发现具有隐性基因ca (编码Jz7WDRl蛋白)的突变体中，除CHS 外，花青素合成途径的结构基因的表达都协同地减少。Walker等人首次通过定位克隆和互补试验发现TTGl蛋白调控花青素的合成和毛状体分化。拟南芥TTGl蛋白含4个WD40基序，其(反2突变体的特点是缺乏表皮毛、种皮透明、种子不经休眠就直接萌发、植株完全缺乏花青素、具有异常的根发育模式等突变表型，这表明TTGl的功能是多效的。棉花GhTTGl 和GhTTG3具有拟南芥AtTTGl的类似功能不仅能够恢复拟南芥ttgl突变体形成毛状体和花青素，而且还能互补紫罗兰ttgl突变体在花瓣产生紫色斑点。De等人在矮牵牛中首次发现WD40蛋白PhANlI，其定位于细胞质，能够连接信号转导与转录激活，能够调控PhAN2 (MYB)的功能。玉米中的PACl与矮牵牛和拟南芥中花青素调节蛋白ANl 1、TTG1极为类似，且 35S-PAC1能够互补ttgl突变体。Dressel等人发现WD基序中单个氨基酸的突变(W158R) 就可抑制DFR基因的表达，进而导致白花表型，且MiTTGl的54. 1%高GC含量是进化的信号。Matus等人在拟南芥中异位表达葡萄勝ZtV导致拟南芥地上部分和莲座叶中花青素的合成，并通过GFP融合蛋白技术证明WDRl定位于细胞质和细胞核。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和MYB蛋白(GL1，PAPl、PAP2、 CPC、TRY)组合，形成MYB/TTG1/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Brueggemann等人通过互补试验证实了苹果MdTTGl具有类似拟南芥AtTTGl的功能。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (TTGl)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、异位表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因 TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl, GL3, GLl和 GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。TTG是多功效基因， Gonzalez等人还发现TTGl能够与MYB5和TT2 (MYB)形成复合物控制外种皮的分化。在苹果中，Brueggemann等人克隆并验证了 MdTTGl基因的功能,但是并没有进行原核表达和纯化蛋白。但是，在体外验证苹果和梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，需要纯化TTGl蛋白。本专利技术选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为实验材料，克隆云南红梨‘云红梨I号’ PyTTGl基因，进行原核表达和蛋白纯化的研究，将为在体外验证苹果核梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，进而在苹果和梨中构建MYB-bHLH_WD40复合物模型及果树和花卉的分子育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种云南红梨/TiW基因，该基因具有如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白质。本专利技术中PyTTGl基因来源于云南红梨。本专利技术另一目的是提供南红梨/TiW基因的原核表达载体pET32a-/y/7i 7，该载体含有r/i 7基因和r/i 7基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均带有6 XHis标签。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTGl中，PyTTGl纯化蛋白应用于研究梨和苹果中TTGl与MYB和 bHLH等互作中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案I、云南红梨r/i 7基因、基因组序列的获得(1)根据苹果量//TiW基因(GenBank登录号为AF220203)编码框序列和原核表达载体pET-32a多克隆酶切位点，设计I对特异弓I物PyTTGl-F 5 ' - 076CCATGGAGAACTCT ACGCAAGAATCG-3' , PyTTGl-R 5/ -07gCTCGAGAACCTTCAAAAGCTGCATCTTG-3'，在上下游引物的5'端分别加入Afc0I和ZAoI酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基);提取云南红梨果皮的总RNA，并以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyTTGl-F和PyTTGl-R进行扩增；提取云南红梨果皮中的基因组，使用上述引物进行扩增；(2)回收的cDNA和gDNA全长片段。2、构建原核表达载体及gDNA的T/A克隆使用AfcoI和通ol MPyTTGl基因全长片段和载体pET32a进行双酶切，分别获得5'和 3'末端分别带有Nco I和Xho I酶切位点的PyTTGl基因和pET32a载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16 °C连接16 h，获得原核表达载体pET32a-/y77^7，进行测序比对分析；使用PMD18T载体，将回收的gDNA片段进行T/A克隆，酶切验证后，进行测序分析，将测序结果进行生物信息学分析，并上传至GenBank数据库；LPyTTGl的原核表达使用热刺激法将pET32a-/y/7i 7转入大肠杆菌力中，在终浓度I mM IPTG 诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；4、PyTTGl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，张晓东，樊磊，崔道磊，陈丽梅，舒群，苏俊，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
0来自[北京市电信互联网数据中心] 2015年01月14日 11:22原名苏淑眉，广东顺德人，先后在广州德明中学、广大会计专科学校与圣罗撒书院求学，课余师从红线女学艺。16岁起加入职业粤剧团，为正印花旦。1951年起参加粤语片拍摄，1956年任光艺影片公司演员，人多尊称为"媚姐"。非常好学，身为红星，八十年代更参加香港的中学会考，报考英文科，一时传为佳话。至1985年参加拍摄粤语片近200部，成名作《唐山阿嫂》，主要作品有《七重天》、《椰林月》、《海棠红》、《天伦情泪》、《紫色风雨夜》、《七十二家房客》等。70年代先后入丽的、无线电视台主持节目并拍摄电视剧集。