本发明专利技术公开了一类基于三嗪结构的糖标记试剂、其制备方法以及在毛细管电泳质谱连用技术(CE-MS)中的检测应用。该类糖标记试剂具有基于三嗪的特征结构，通过结构上的肼基在还原或非还原条件下共价耦联糖类样品。标记后的样品经过预处理(还原标记)或者直接(非还原标记)进行CE-MS分析。该类标记试剂以及标记分析方法的应用前景广阔，可包括临床诊断，疾病的早期诊断，生物制剂活性与均一性的分析等等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类基于三嗪结构的糖标记试剂制备及其在毛细管电泳质谱连用技术(CE-MS)中的检测应用。
技术介绍
糖是组成生命体最基本的四种生命分子中的一大类。广泛存在于人体内，据估计人体70%以上的蛋白均为糖基化的蛋白。蛋白的糖基化在蛋白质结构和功能的调节上起着非常关键的作用。糖基化水平的改变通常是蛋白结构与功能变化的标志。因此糖的研究得到来自临床和生物制剂领域的极大关注。由于绝大部分的糖都没有可以用于检测的生色基团，因此难以用光学手段进行检测，同时大部分的糖很难离子化，因此质谱的检测也存在着相当大的困难。为了解决这些问题，在过去的几十年里，多种基于不同检测手段(紫外可见，荧光等)的糖标记试剂被开发出来。CE-MS(毛细管电泳-质谱连用)在分析水溶性的极性样品上具有高效液相色谱质谱连用技术所不具备的优势，其具有样品消耗小，分离效率高，同时定性能力强的特点。因此该技术有潜力成为对于糖类样品分析的理想方法。然而由于一直没有适合于该方法的糖类标记试剂，从而在很大程度上限制了这一技术在糖类分析中的进一步发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一类基于三嗪结构的糖标记试剂及其合成方法和应用。本专利技术提供的一类新型糖标记试剂为3种不同取代的三聚氯氰T1/T2/T3，其结构式分别为Tl的结构式权利要求1.一种糖标记试剂，其特征在于具有以下T1、T2或Τ3所代表的分子结构2.一种稳定同位素糖标记试剂，其特征在于，具有以下Τ3-1、Τ3-2或T3-3所代表的分子结构3.—种权利要求I中所述的糖标记试剂的合成方法，其特征在于2-氯-4，6- 二甲氧基-S-三嗪溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时后，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到Tl所示的糖标记试剂；或(I)将三聚氰氯溶于一定量甲醇，加入过量碱，在冰浴条件下搅拌反应过夜，层析色谱监控至反应完全，待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末，(2)将上一步产物溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃中，加入过量的三级胺N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，室温下加入当量二乙胺，室温下搅拌继续反应Ih-过夜，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(3)上步产物溶于一定体积的有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T2所示的糖标记试剂；或(I)三聚氰氯溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈、或四氢呋喃中，加入过量三级胺N， N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应 Ih-过夜，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T3所示的糖标记试剂。4.一种权利要求2中所述的稳定同位素糖标记试剂的合成方法，其特征在于(I)三聚氯氰溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃中，加入过量三级胺N， N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量氘代二乙胺或15N代二乙胺，室温下搅拌继续反应lh-24h，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T3-1或T3-2所示的稳定同位素糖标记试剂；或(I) 13C代三聚氯氰溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃，加入过量三级胺 N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应 lh-24h，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗三次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取三次，浓缩得到T3-3所示的稳定同位素糖标记试剂。5.权利要求I或2所述的糖标记试剂在毛细管电泳-质谱连用分析、即CE-MS分析中的应用。6.一种基于权利要求I中的糖标记试剂Tl、T2的多糖标记方法，其特征在于，将过量的标记试剂Tl或T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中，体积比v&K_g Vdmso =9: I I : 1，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液，将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀，将混合溶液在65-75°C的烘箱中反应I. 5-3小时，反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。7.一种基于权利要求I中的糖标记试剂T3的非还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，(1)针对水溶性糖类样品的标记方式为将多糖的水溶液与有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇按照体积比Vwmsjw : V*=9 : I I : 5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的标记物T3，混合均匀，50-75°C下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存，或(2)针对干粉糖类样品的标记方式为将过量的标记试剂T3加入有机溶剂甲醇、乙醇、 丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇与水的混合溶液中，体积比Vwmsjw : V#=9 : I I : 5，加入催化量的冰醋酸，混合均匀，配制成为标记溶液，将标记溶液与粉末糖类样品混合，50-750C 下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。8.一种基于权利要求I中的糖标记试剂T3的还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，将过量的标记试剂T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中，体积比Vwgig Vdmso =9: I I : 1，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液；将标记溶液与水溶性糖类样品按体积比: VP = 9 : I 4 : I的比例混合均匀，或者将标记溶液与糖类干粉样品混合均勻；将混合溶液在65-75°C的烘箱中反应I. 5-3小时,反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，-20°C保存。9.一种基于权利要求2中的稳定同位素的糖标记试剂T3-1、T3_2或T3-3的非还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，(1)针对水溶性糖类样品的标记方式为将多糖的水溶液与有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇按体积比Vwmsjw : V*=9 : I I : 5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的稳定同位素标记试剂T3-1、T3-2或T3-3，混合均匀，50-75°C下反应1_3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存；或(2)针对干粉糖类样品的标记方式为将过量的稳定同位素标记试剂T3-1、T3-2或 T3-3加入有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇与水的混合溶液中，体积比Vwm 溶剂:V#=9 : I I :本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张新祥，铁偲，周颖琳，赵明哲，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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