本发明专利技术涉及一种HPV16L1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用，包括重组人乳头瘤病毒L1衣壳蛋白的氨基酸序列，编码该氨基酸序列的合成核苷酸序列，和包含该核苷酸序列的重组表达载体和汉逊酵母表达宿主菌株。本发明专利技术还涉及由该氨基酸序列及其衍生物所组成的HPV16L1蛋白在制备疫苗中的应用。本发明专利技术通过对HPV16L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重组HPV16L1衣壳蛋白在汉逊酵母系统中高效表达，使得利用汉逊酵母表达系统工业生产HPV16L1衣壳蛋白成为现实，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产率更高、成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，尤其是涉及一种HPV16L1多核苷酸序列，还包括一种表达载体、宿主细胞及其多核苷酸序列、表达载体和宿主细胞在制药和制剂方面的应用。
技术介绍
在多种物种包括绵羊，狗，兔子，猴子，牛和人中已发现乳头瘤病毒的感染。人乳头瘤病毒(简称HPV)已分出上百个型别，如果LI基因与以前鉴定的型别的LI序列的同一性低于90%，那么这种型别可确定为新的型别，如果LI氨基酸序列同一性是在90到98%之间则为亚型，同一性在98%以上为变体。人乳头瘤病毒是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，目前已发现 100多种亚型。致病HPV的类型主要有6，11，16，18等。依据HPV能否致癌可将其分为致癌的高危型和不致癌的低危型两类。低危型HPV主要包括6，11，13，32，42，43，44等。高危型 HPV 主要包括 16，18，45，52，56，58 等。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位；每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，其中，80%的死亡发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13. 8万， 每年约有5万人死于宫颈癌。大量研究资料证明，生殖道的人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌有着十分密切的关系-约80%的宫颈癌与4种类型(16、18、31型和45型)的HPV感染有关，其中，50%的宫颈癌与HPV16感染相关。目前，临床上尚无预防HPV16感染的措施， 而且对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果也不理想。宫颈癌的复发率较高且治疗费用也高。2005年，美国约有I万例新确诊的宫颈癌患者，约有3700例患者死亡。在大多数人中， 人乳头瘤病毒可于感染后自行消失。然而，少数情况下，某些高危类型的人乳头瘤病毒如果未被检出和治疗，可以导致宫颈癌。此外，某些低危类型的人乳头瘤病毒可以导致尖锐湿疣。在美国，每年用于宫颈癌筛查和治疗的费用约为5. 7亿美元，每年约有100万例尖锐湿疣，约有470万女性由于巴氏涂片检查(Pap)结果异常需要进行随访，其中，至少有300万例此类异常结果是由某些人乳头瘤病毒导致的。HPV是一种小的DNA病毒，直径45_55nm，衣壳呈二十面体立体对称，没有囊膜，完整的病毒颗粒氯化铯中浮密度为I. 34g/mL，在密度梯度离心时易与无DNA的空壳(密度 1.29/mL)分开。HPV基因组是一闭环双股DNA，分子量5*106道尔顿。按功能可分为早期 (E区)，晚期(L区)和非编码区(NCR)三个区域，E区分为E1-E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。例如El蛋白是一种DNA解旋酶，参与病毒 DNA复制过程的起始，E2是一种调控蛋白，控制病毒基因的表达和DNA的复制。E2通过其既结合El又结合病毒复制起点的作用，使El在所述起点局部聚集，从而，刺激病毒DNA的复制起始。E4蛋白具有多种没确定的功能，但结合宿主细胞骨架属于上述功能，E5延迟体内的酸化，导致细胞表面的EGF受体表达增加，已知E6和E7各自都能结合细胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成与宫颈癌有关的HPV型别，是已知的致癌基因。NCR是E区与L区间-6. 4-1. Okp的DNA片段，可负责转录和复制的调控。L区分LI和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。已经鉴定LI和L2基因是好的免疫预防靶，对于棉尾兔乳头状瘤病毒(CRPV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)系统的研究表明，用细菌中表达的LI和L2蛋白或使用疫苗载体的免疫方法能保护动物不受病毒感染。在杆状病毒表达系统中表达人乳头状瘤病毒LI基因或使用疫苗载体导致组装成病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。大量研究已表明，VLPs具有良好的免疫原性和反应性，高诱导机体产生高滴度的中和抗体，以此为基础来研制疫苗显得很有前途。 LI基因编码的主要衣壳蛋白能刺激机体产生保护性抗体，可避免机体再受同型别HPV的感染。疫苗在历史上一直被视为预防病原体感染的一种方式，如果发生感染，疫苗可激发免疫系统，以识别并中和病原体。疫苗包含一种或多种来自病原体的抗原，通常是已灭活的或减毒的完整生物体，或者是来自所述生物体的特定抗原肽，当将免疫系统暴露于抗原时，产生使个体终生保持对所述抗原免疫记忆的细胞。再次接触相同抗原包括感染所述病原体时刺激特异性免疫应答，从而清除感染的病原体或使感染的病原体失活。有关HPV的基础研究的高峰期已经过去，应用时代包括诊断和疫苗的临床应用正在走来，特别是高危型如HPV16U8的预防性疫苗产品即将得到越来越广泛的临床使用甚至是广泛普及。截至目前，世界上开发成功的宫颈癌疫苗主要是两种预防性疫苗一种是 Merck(默克)药厂研制的四价疫苗，主要针对引起宫颈癌的两个HPV高危型16、18和引起生殖道尖锐湿疣的两个HPV低危型6、11 ;另一种是GSK (葛兰素)药厂研制针对HPV高危型16、18的二价疫苗，2006年6月先后获得欧洲与美国FDA的批准上市。默克公司应用啤酒酵母和葛兰素史克公司应用昆虫细胞-杆状病毒研发的人乳头瘤病毒疫苗都已上市，主要在欧洲免疫接种，一人份的费用是350美元，这个价格在我国显然太高，不能被普通大众接受。对于基因工程蛋白疫苗的研制，除了目的基因的选择之外，重组蛋白表达系统的选择也同样重要。对于整合表达系统所表达的LI蛋白，可自我组装成VLPs。目前国际上研究较多，适合工业化生产的是酵母表达系统，它不仅具有原核表达系统快捷、方便、费用低等优点，并且兼有真核表达系统的翻译后加工、修饰等特点，使表达的LI蛋白能自我组装成 VLPs，具有良好的抗原性。本专利技术中使用的表达系统中宿主细胞为汉逊酵母(Hansenula polymorpha),甲醇酵母是近几年逐渐发展起来的一类作为细胞工厂表达外源基因特别是真核生物基因的理想宿主，其中多形汉逊酵母是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统，适于大规模工业化生产外源蛋白，汉逊酵母的技术优势和产业化应用价值可归纳为(I)最适生长温度高(37 43°C，毕赤酵母与酿酒酵母为28°C)，生长速率快，利于大规模发酵生产，可以高效表达许多在其它系统中难以高效表达的基因。(2)外源基因整合于细胞染色体中，重组菌株有丝分裂遗传稳定性高。(3)能利用廉价的化学合成培养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天然组分(如酵母粉、蛋白胨)，进一步降低了生产成本并提高了外源基因的表达水平。易于培养，能够在廉价培养基中高密度培养，菌体密度高达100 130g/L干重。(4)具有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子。汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需基因，对进行多基因改造提供了有利条件。(5)多形汉逊酵母具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高等优点，是一个已得到广泛关注的外源基因表达系统。(6)在分泌型表达中，外源蛋白通过分泌途径可完成蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工过程，使所表达的蛋白更接近具有生物学活性的天本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王昌华，杨珺，齐怀丰，李建，王艳侠，汪志良，张涛，宋立娜，王玉香，孙长海，汪和睦，
申请(专利权)人：天津超然生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。