本发明专利技术公开了一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒。所述方法包括以下步骤：（1）将纳米富集材料加入到20L~30L水生动物生活水体中富集水病毒；（2）对步骤（1）的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；（3）将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；（4）将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；（5）加入磁铁，混匀后静置，将纳米磁珠吸在磁铁上；（6）取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中。本发明专利技术可以有效富集水体中的水病毒，并能预扩增和保持富集的水病毒的活性，适用于渔场和野外水域中水生动物生活水体中水病毒的监测和检测采样。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒。
技术介绍
鱼虾蟹贝和两栖爬行动物的病毒性疫病是严重威胁水生动物养殖业健康发展和物种多样性和环境生态安全的关键因素。如何能够高效能的从水生动物生活水体中吸附富集染疫水生动物排放到生活水体中的病毒颗粒用于实验室的疫病病原微生物检测，是一项非常有意义的工作。目前，水生动物疫病检测标准中规定的样品采集方法一般都是针对活体动物或濒死动物的组织脏器进行采样，然后研磨组织样品以后进行病毒的分离培养和病毒鉴定。如鲤春病，一般病鱼的初步诊断是根据病鱼外表特征与临床症状作出初步判断。 春季水温低于20°C时，养殖鲤易出现典型的SVC症状。有时鱼类大规模死亡时并无明显外表症状，需通过解剖观察内部器官典型症状。病料宜采集肝、肾、脾和脑。血液、脑病毒滴度不高，但持续时间最长，而鳃、血液和肠病料存在干扰物。OIE建议，幼鱼宜采集肾和脑病料为佳，较大鱼应采集肝肾、脾和脑组织为佳。实验室确诊可用EPC等敏感细胞培养分离病毒，然后采用病毒中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR等方法鉴定。上述方法可用于发病鱼或无症状染疫鱼检测。也可以采用免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR 等方法直接检测病料中的病原，但确诊须通过培养法分离病毒，以防假阳性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法。该方法可以有效富集水生动物，例如鱼类、两栖类、爬行类动物生活水体中的水病毒(如鱼类和蛙病毒属病毒)，并能预扩增和保持富集的水病毒的活性，适用于渔场和野外水域中水病毒的监测和检测采样。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是本专利技术提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法，该方法包括以下步骤(1)将纳米富集材料加入到20L 30L水生动物生活水体中富集水病毒；(2)对步骤(I)的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；(3)将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；(4)将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；(5)加入磁铁，混匀后静置，使纳米磁珠吸在磁铁上；(6)取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中，病毒释放在保存液中，并在相应的敏感鱼类细胞系内进行预扩增。其中，所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体中水病毒的纳米富集材料I，该纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；或用于富集水生动物海水生活水体中水病毒的纳米富集材料II，该纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe3O4纳米磁珠；所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，例如199细胞培养液、MEM细胞培养液、L15细胞培养液等；并且在细胞培养液中添加了相应的敏感鱼类细胞，青霉素(100U/ ML)、链霉素(O. lmg/ML)和制霉菌素(25U/ML)，并且调最终细胞培养液的pH为7. 5^8. 5。所述鱼类细胞为CO (Ovary of grass carp 草鱼性腺细胞)，EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞)，FHM(fathead minnow 胖头鱼肌肉细胞)，CLC (Carp leucocytes cell 鲤鱼白血球细胞)，CIK(kidney of grass carp 草鱼肾脏细胞)，CHSE (chinook salmon embryo 大菱大马哈鱼胚胎细胞)，CCO (Channel catfish ovary It鱼性腺细胞)，BF_2 (Bluegill fry 蓝太阳鱼觸细胞)，Rl (liver of rainbow trout 虹鳟鱼肝细胞)，RTG-2 (rainbow trout gonad虹鳟鱼性腺细胞)中的一种或几种。根据目的要富集和预繁殖的病毒种类选择相应的敏感细胞系。进一步地，步骤(I)中，富集水病毒的具体方法为将IOg 50g纳米富集材料加入到 20L 30L水生动物生活水体中，搅拌3min使之混匀，然后静置0. 5tT24h。进一步地，步骤(2)中，过滤时采用滤纸进行过滤。进一步地，步骤(3)中，所述病毒释放缓冲液为含有3%牛肉膏的0.05mol/L甘氨酸的水溶液，PH值为9. 5，所述沉淀物与病毒释放缓冲液的质量体积比为质量体积比为 Ig:I 5ml ο进一步地,步骤(4)中,所述纳米磁珠与上清液的质量体积比为lg:l、0ml。本专利技术还提供了一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒， 该试剂盒是由以下试剂组成试剂A :纳米富集材料I，所述纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；试剂B :纳米富集材料II，所述纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；试剂C :滤纸；试剂D :病毒释放缓冲液；试剂E :纳米磁珠，所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe3O4纳米磁珠，分散性能良好，粉体饱和磁化强度为64-65emu/g,超顺磁性能良好；试剂F :磁铁；试剂G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，并且在细胞培养液中添加了相应的敏感鱼类细胞、100U/ML青霉素、0. lmg/ML链霉素和25U/ML制霉菌素，所述细胞培养液的PH为7. 5^8. 5。所述鱼类细胞为草鱼性腺细胞、鲤鱼上皮瘤细胞、胖头鱼肌肉细胞、鲤鱼白血球细胞、草鱼肾脏细胞、大菱大马哈鱼胚胎细胞、鲶鱼性腺细胞、蓝太阳鱼鳃细胞、虹鳟鱼肝细胞、虹鳟鱼性腺细胞中的一种或几种。所述病毒释放缓冲液为含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值为9.5。本专利技术的有益效果(I)本专利技术利用纳米材料对病毒颗粒高吸附性能，以及磁性纳米颗粒的磁性能有效地从水体中富集分离出一系列水病毒，例如鲤春病病毒、传染性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病病毒、流行性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、蛙病毒属病毒、鲑鱼传染性贫血症病毒、对虾白斑症病毒、对虾桃拉综合征病毒、黄头病病毒、传染性皮下和造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒病等。所述方法及试剂盒的应用能够替代采集活体水生动物送检实验室的工作，对水生动物个体没有损伤，减少了样品运输费用和剖检动物的工作量。降低了水生动物疫病在样品运输过程中造成的疫病流行的可能性。(2)本专利技术的水生动物病毒保存液可以达到将相应的病毒加入相应的敏感细胞系培养悬液中进行病毒预繁殖扩增的效果，以及保证水生动物病毒在长途运输中的活性的保护，以及防范细菌和真菌污染的措施，较高的pH值可以保证病毒从磁珠上的释放效果和防范培养液PH值下降带来的病毒降解的可能。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但这些实施例仅限于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I纳米富集材料的制备所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张利峰，王姝，高隆英，张雷，张旻，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。