检测蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸及其制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术首先纯化了蜡样芽孢杆菌菌体和芽孢，然后用纯化的蜡样芽孢杆菌菌体和芽孢作为免疫原，制备多克隆抗体和单克隆抗体。用胶体金标记单克隆抗体作为示踪物，分别在检测线和指控线位置包被抗菌体、芽孢的多克隆抗体和兔抗鼠的多克隆抗体。可以根据检测线和质控线的显色与否判定阴阳性结果。本发明专利技术具有测定简便、特异性强、敏感性高等特点，可以方便、快捷、准确的在几分钟内检测蜡样芽孢杆菌菌体及芽孢，也可用在商品流通领域及生产过程中是否污染了蜡样芽孢杆菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸及其检测方法，同时还涉及该试纸相关试剂的制备方法。专利技术的
技术介绍
蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，因此无法避免地会污染到食品中。几乎所有种类的食品都曾被报道与蜡状芽孢杆菌引发的食物中毒有关，主要有乳品、 米、蒸煮的米饭和炒饭、调料、干制品(面粉、奶粉等)、豆类和豆芽、肉制品、焙烤食品等。所有芽孢杆菌种类能形成热稳定内生孢子，蜡样芽孢杆菌孢子是食源性疾病的一个重要因子。孢子的D95°C从低于Imin到超过30min，观察不到孢子的新陈代谢活动，但孢子可以在没有营养的条件下存活许多年。内生孢子是休眠、硬的和非再生结构。内生孢子最初的功能是确保細菌能承受环境压力。抱子高度耐热、干燥、有毒化学物质、UV射线、γ 射线和其他不利的环境因素。芽孢杆菌孢子是最耐受灭活的生命形式蜡状芽孢杆菌是条件致病菌，偶尔能导致人的眼部感染，甚至是心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒腹泻型和呕吐型。一般认为肠毒素在胃中会被破坏，所以腹泻型食物中毒是由残留下来的蜡状芽孢杆菌(芽抱或菌体)在小肠中生长、产肠毒素引起的，具体过程尚未完全明了。多数情况下，引起该类食物中毒的食品中蜡状芽孢杆菌的数量在105 108CFU/g，也有在数量较低的情况下 (IO3 104CFU/g)导致食物中毒的。其症状类似于产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)食物中毒水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。常因食用肉类、海鲜、 乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6 15h，一般持续Mh ；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3结合，导致呕吐。 所以尽管有时食物中检出的蜡状芽孢杆菌数量很低(102CFU/g)，却仍能引发呕吐中毒。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0. 5 6h，一般限于富含淀粉质的食品，特別是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无カ等症状，与金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)引发的食物中毒相似。从目前的报道看，由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒在亚洲以呕吐型比较常见，而在欧洲和北美地区则以腹泻型更常见。目前，食品中蜡样芽胞杆菌的检测主要采用传统的细菌分离及生化鉴定方法，该法费时费力，极大限制了在食品加工中对该菌污染的有效监控.为提高食品安全性，建立 ー种快速灵敏的检测方法十分必要。免疫层析法(Immunoehromatography)是20世纪90年代兴起的ー种快速诊断技术，胶体金免疫层析技术(GICA)就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物而发展起来的。在该技术基础上研制的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、制作方便、价格低廉、容易操作、结果直观、无须仪器设备等优点，满足了现场快速检测及实时监测等方面的要求，具有广泛的应用价值。本专利技术所解决的问题本专利技术以蜡样芽孢杆菌作为检测对象，可以同时检测蜡样芽孢杆菌菌体和芽抱， 可以克服传统方法检测中无法区分蜡样芽孢杆菌菌体和芽孢的缺点。结合胶体金免疫层析技术使本专利技术的检测方法更加特异、快速、针对性强，实用和方便。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测样品中蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸及其制备方法。该试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC底板組成。PVC背衬一端依次粘有样品垫、胶体金垫、中间部附有硝酸纤维素膜、另一端粘附有吸水紙。所述样品垫与所述胶体金垫之间有搭接；所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接；所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接；所述胶体金垫是有吸附有胶体金标记的抗蜡样芽孢杆菌的单克隆抗体的玻璃纤维素膜构成，所述硝酸纤维素膜上分別包被有抗蜡样芽孢杆菌多克隆抗体构成的检测线和兔抗鼠的IgG构成的质控线。用于检测蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸条及其制备方法，填补了目前国内尚未有检测蜡样芽孢杆菌免疫胶体金试纸条的空白和检测蜡样芽孢杆菌菌体和芽孢的快速检测方法的空白。本专利技术具有以下优点1、本专利技术的检测蜡样芽孢杆菌的免疫胶体金试纸条，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的优点。2、本专利技术的检测试纸条不需要特殊仪器、设备，技术简单，检测成本低。该试纸的制备方法包括以下步骤1)抗原的制备将蜡样芽孢杆菌的菌体和芽孢通过化学物质的作用及离心方式分开。2)单克隆抗体的制备将纯化的抗原，分三次免疫BALB/c小鼠，取免疫后小鼠的脾脏进行細胞融合，经过亚克隆筛选后，用间接ELISA检测效价，选取其中分别针对菌体和芽孢效价最高的杂交瘤細胞株进行后续试验。3)单克隆抗体的大量制备及提纯采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，将杂交瘤細胞株注射于已致敏的小鼠腹腔，12-15d待小鼠腹腔明显隆起收集腹水，腹水经试剂盒纯化，经测定抗体纯度达到95%。4)抗蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备将纯化的抗原，分3次免疫家兔后采取抗血清。多克隆抗体经试剂盒纯化，经测定抗体纯度达到95%。5)兔抗鼠IgG多克隆抗体的制备将纯化的小鼠lgG，分3次免疫家兔后采取抗血清。多克隆抗体经试剂盒纯化，经測定抗体纯度达到95%。6)胶体金探针的制备用柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金，之后以0. 9mg/ml比例加入纯化的抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体，进行高速离心后用专用溶液保存。7)胶体金垫的制备将胶体金探针均勻的涂布在玻璃纤维上，在室温下烘干，制成胶体金垫。8)用专用的包被稀释液稀释好抗蜡样芽孢杆菌多克隆抗体、兔抗鼠ニ抗分别包被在硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，喷涂之后室温干燥。49)组装试纸条，PVC底板上一次黏贴样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水紙。 将组装完的试纸条切成3mm的宽度。具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不仅限于本专利技术。实施实例一抗原的制备芽抱抗原的获得将培养物干30°C培养10-12d。当孢子生成量最大吋，培养物用无菌水收集下来， 并洗涤两次，然后用无菌水重悬。为了使芽孢从营养体細胞的碎片中游离出来，需要进行进一歩的处理。蜡样芽孢杆菌在硫柳汞(1 20000)的稀释液中，于37°C培养4天，直至营养体细胞裂解彻底。用上述方法制得的芽抱，在无菌水里洗6次，重悬于生理盐水中，剧烈震荡lOmin， 慢速离心使大的孢子团沉淀。硬度平稳的悬浮物被稀释到浊度相同的等分，至布朗浊度为 8号，并储存于4°C。如果没有特别说明，用于凝集或沉淀反应的芽孢悬浮物为未经加热的。 用于抗血清制备的通常是121°C 20min.菌体抗原的获得培养物在营养肉汤中培养，接种ー环隔夜的培养物，在30°C下培养12h，轻微振荡。培养物离心，細胞用25ml生理盐水复溶，洗六次。最后一次离心后悬浮于生理盐水中， 剧烈震荡lOmin，轻微离心除去细胞聚集物。均勻的悬浮物上清用吸管吸出，用无菌盐水稀释。菌体細胞在100°C下加热lh，并保存于4°C备用。实施实例ニ 免疫胶体金试纸条的制备将PVC做背村，上面一端依次粘有吸水紙、样品垫、胶体金垫、中间部附有硝酸纤维素膜、另一端粘附有吸水紙。胶体金垫是有吸附有胶体金标记的抗蜡样芽孢杆菌的单克隆抗体的玻璃纤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张金兰，赵燕，王夫杰，张建，渠岩，
申请(专利权)人：北京市食品酿造研究所，
类型：发明
国别省市：