本发明专利技术涉及一种定向改造可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的分子结构，并采用高通量技术筛选热稳定性突变体的方法。其特征在于：通过易错PCR构建s-GDH的高容量突变文库，利用浸有有色底物的滤纸在菌落平板上进行原位筛选，并结合菌落直接转化法，获得s-GDH热稳定性提高的突变体。与野生型s-GDH相比，所述的s-GDH突变体的热稳定性获得了显著提高。得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶为进一步扩大葡萄糖脱氢酶的应用范围奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶热稳定性提高的突变体以及筛选热稳定性突变体的高通量筛选方法，属于酶的基因工程
技术介绍
血糖浓度测定在糖尿病的临床诊断和管理中极为重要。目前，我国约有成年糖尿病患者9700万人，还有1. 48亿糖尿病前期患者，已经超越西方发达国家，成为全球糖尿病人最多的国家，糖尿病将是未来我国严重的公共卫生问题之一，而血糖监测越来越受到重视。血糖检测在自我诊断检测市场中占据了近16%的市场份额，资料显示，目前全球糖尿病患者已达3. 66亿人，全世界血糖检测市场容量为50亿美元，90%欧美等发达国家的糖尿病患者通过血糖仪进行自我监测。可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1. 5. 2，简称s-GDH)，是一种可以将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的氧化还原酶，因此该类型酶可用于检测血糖。吡咯喹啉醌(PQQ)是继黄素核苷酸(FMN、FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD、NADP)后的第三种新型辅酶。后来又相继发现一些与PQQ结构类似的辅酶topaquinone (TPQ) Uysine tymsylqllinone (LTQ)、tryptophantryptophylquinone (TTQ)，这四种辅酶并称为醌式辅酶，以PQQ、TPQ、LTQ、TTQ为辅酶的氧化还原酶统称为醌蛋白酶或醌酶。吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶是一类主要的以PQQ为辅酶的醌蛋白，因其独特的性质而备受关注。醌蛋白广泛存在于革兰阴性菌的胞外周质中，部分溶于胞外周质，部分与细胞膜的外表面相连，组成了一个与细胞膜上呼吸链相偶联的胞外周质氧化还原系统，传递电子到细胞膜上的电子受体。这种胞外周质氧化还原系统的特征是缩短了电子传递的路径，减少了底物氧化和产物释放所需的能量。吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶因其存在的部位不同，又分为膜结合型即m-GDH 和水溶型即s-GDH。m-GDH存在于多种革兰阴性菌中，如不动杆菌属、假单胞菌属和醋酸菌属的细菌，位于这些细菌的细胞膜外表面，可直接氧化D-葡萄糖生成脂类或葡萄糖酸。该酶是单亚基组成的醌蛋白，只由一条87kD的肽链构成，有5个穿膜结构，为高度疏水。其底物专一性较高，除了葡萄糖可以氧化己糖、戊糖等单糖，但不会氧化二糖。s-GDH是来源于醋酸钙不动杆菌的可溶性醌蛋白，发现于醋酸钙不动杆菌的周质空间内，目前只在不动杆菌属中有发现。s-GDH被证明是区别于m-GDH的第二种PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶，且二者同源性很低。该酶是同型二聚体，每个亚基的相对分子质量为50，000，N端是一个由对个氨基酸残基组成的信号肽，在分泌到胞外周质中后被切除。该酶不参与醋酸钙不动杆菌中的呼吸链，生理学功能未知。该酶可以催化各种单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且s-GDH可以将电子提供给PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP (2，6- 二氯靛酚)、 WB(ffurster氏蓝)短链泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工电子受体如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和导电聚合物等。s-GDH与其他的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶相比，具有极高的反应活性，反应灵敏；而且辅酶与蛋白结合紧密不需反应中额外添加辅酶(如NAD)；此外，反应过程中氧气不会作为电子的受体而不受氧分压干扰及广泛的人工电子受体特异性。这些优点使s-GDH在血糖检测以及微体积、快速响应的葡萄糖传感器等方面有着重要作用和应用。尽管使用s-GDH有上述讨论的优点，但是其热稳定性较差，在使用过程中如果遇到较高温度的环境很容易失活。近来，针对热稳定性差的缺点，Sode等在用PCR方法进行了一系列的定点突变，选择多肽链侧链基团表面231位的丝氨酸残基分别代之以半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，都使酶的稳定性得到了一定程度的提高，其中以Ser231LyS在保持高活力的前提下稳定性增加最明显，与野生型相比，55°C半衰期提高了 8倍，但仍然保持其原有酶活力。根据通过增加两个亚基之间的结合力而提高稳定性的原理，采用的其他方法有①采用戊二醛将两个亚基的C、N端进行化学交联，55°C半衰期达到63min ；②利用基因工程的方法，在两个亚基的中间添加了一段连结肽 Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gln,半衰期 16min ；③在两个亚基的接触表面进行突变，Asn340Phe/Tyr418Ile和Thr416Val/Thr417Val，增加亚基间的疏水作用力，半衰期16min。选择sPQQGDH多肽链侧链基团表面415位的丝氨酸残基代之以半胱氨酸，突变后的sPQQGDH与野生型相比，在保持其原有的催化活力的前提下，55°C热稳定性增加了 30倍，70°C孵育IOmin后，Ser415Cys仍然保持着90%的活力。定向进化属于非理性设计，已经成为体外改造酶分子的一种策略，不用事先了解蛋白质的结构、保守位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，在体外模拟达尔文进化过程，通过建立随机突变文库或重组基因库，再经过合适的筛选，获得具有性质明显提高的蛋白质。酶定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，具有很大的应用价值。可溶性葡萄糖脱氢酶的优良性质使其在血糖检测和葡萄糖传感器等方面的应用有着极大的潜能，但是较差的热稳定性则限制了其进一步的应用，因此通过生物技术手段提高它的热稳定性成为s-GDH研究中的一个重要方向，得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶具有重要的意义，不仅可拓宽酶的工业应用范围，而且可研究酶结构与稳定性的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对市场上可溶性葡萄糖脱氢酶热稳定性差的问题，专利技术的任务是通过定向进化技术与高通量的筛选方法提供与野生型酶相比热稳定性得到显著提升的新型s-GDH突变体或变异体。本专利技术的技术方案一种热稳定性提高的S-GDH突变体，其特征在于野生型S-GDH 位于111，263，270，331，347，416位中的氨基酸中有一个或多个被取代，其中这些位置对应于由醋酸钙不动杆菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列 (SEQ ID NO 2)已知的氨基酸位置。s-GDH突变体的高通量筛选方法，通过易错PCR构建 s-GDH的高容量突变文库，利用浸有有色底物的滤纸在菌落平板上进行原位筛选，并结合菌落直接转化法获得s-GDH克隆子，得到s-GDH热稳定性提高的突变体。与野生型S-GDH相比，所述的S-GDH突变体的热稳定性获得了显著提高。得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶为进一步扩大葡萄糖脱氢酶的应用范围奠定了基础。编码本专利技术的s-GDH突变蛋白的多核苷酸序列以及含这种多核苷酸序列的表达载体和含所述表达载体的宿主细胞也是本专利技术的方案。本专利技术还涉及本专利技术的突变体在葡萄糖检测方法中的用途，尤其是在通过测试条装置或用生物传感器进行的葡萄糖检测方法。附图说明图1 含有野生型或s-GDH突变体的表达载体结构2 易错PCR的琼脂糖凝胶电泳3 定向进化筛选示意4 野生型及s-GDH突变体在55 °C的热稳定性分析具体实施例方式具本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，于怡，黄磊，朱建忠，杨叶东，
申请(专利权)人：浙江德清汇宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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