一种芯片法邻位连接技术制造技术

本发明专利技术的实施方式包括检测样品中目标分析物的方法，系统及探针。此方法利用对同一个分析物分子中的至少两个不同位点检测，或者两个相邻和接触分子的两个不同位点配对。这些不同位点是一单个分子不可缺少的一部分，或者由于多肽三维结构而彼此相近。通过一个更大分子修饰可形成至少一个可检测位点。检测一个目标分析物的方法包括将样品与一对探针结合，每个探针包含一个可特异结合目标分析物或标签的结合基，及一个寡核苷酸尾巴。这个寡核苷酸尾巴包含一个接近目标分析物结合基的PCR启动子区域，一个唯一与目标分析物结合基有关的条形码区域，一个互补于连接器寡核苷酸一个区域的连接器-杂交区域；将连接器寡核苷酸与探针上的连接器-杂交区域杂交，连接探针间的连接器-杂交区域；PCR扩增已连接的寡核苷酸尾巴；用基质固定的与探针条形码互补的寡核苷酸杂交扩增产物；消化任何DNA单链分子；用一个信号寡核苷酸杂交前一步骤的产物；检测信号，从而检测出样品中的分析物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及检测多肽及其它分子间关系的方法，这些方法进一步涉及基于阵列的系统。
技术介绍
40年来，酶联免疫吸附试验通常在实验室用于细胞因子检测及定量。在此方法中， 目标蛋白首先被固定于固相基质上。然后，被固定的蛋白与偶联酶分子的抗体结合，最后通过加入可产生检测信号的底物孵育酶复合物检测目标蛋白，并且产生的信号强度与目标蛋白的浓度成正比，及可通过平行标准内参定量蛋白。如果目标蛋白是通过与被固定的特异抗体结合而被捕获，即是夹心法ELISA试验。夹心法ELISA采用一对蛋白特异抗体，大大提高试验的特异性和灵敏度。邻位连接技术(PLA)是最近发展起来的通过DNA序列检测反应分析特异蛋白的方法。在此方法种，目标分子被两个或更多邻位探针识别，邻位探针是由蛋白结合部分与DNA 链结合而成。当三个探针结合到同一普通目标分子上时，其中两个探针尾部的游离端在空间上紧密靠近而与第三探针寡核苷酸杂交。加入一个恰好覆盖前两个寡核苷酸探针3’端及 5’端间隙的盒式寡核苷酸，并通过DNA连接酶连接成新序列。然后，连接产物通过PCR扩增并与未反应探针区分。(例如，请看文献,Fredriksson et al.，(2002)Nat. Biotechnol. 20 473-477,Gullberg et al.，(2004)Proc. Natl Acad. Sci. U. S. Α. 101 :8420-8424,Gullberg et al.，(2003)Curr. Opin. Biotechnol. 14 1-5，Pai et al.，(2005)Nuc. Acids Res. 33 el62 ；US Patent Applications 2002/0064779 ；2005/0003361.
技术实现思路
简单描述的本申请的实施方式，除其它外，包括检测样品中目标分析物的方法。此方法利用同一个分析物分子中的至少两个不同位点，或者两个相邻和接触分子的两个不同位点配对。这些不同位点也许，但并不一定，是一单个分子不可缺少的一部分。例如，一个可检测的位点也许是一个多肽序列的一个或多个氨基酸的组合。这些氨基酸也许在序列上相邻，或者由于多肽三维结构而彼此相近。据假设，通过一个大分子修饰可形成至少一个可检测位点。例如，小分子，但不限于，如一个磷酸基团，一个糖基化组分，诸如此类，可结合目标分析物以形成一个可被识别和被特定探针结合的独特结构。小分子可能是一个标签，如， 但不仅限于，染料，地高辛，并可被一个探头识别。因此，本申请的一个方面是提供检测目标分析物的方法，包括(i)获得怀疑包含目标分析物的样品；(ii)第一探针和第二探针与样品连接，其中第一探针和第二探针各自独立包含一个能够特异性结合目标分析物或标签的结合基，及一个寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一个接近目标分析物结合基的PCR启动子区域，一个唯一与目标分析物结合基有关的条形码区域，一个互补于连接器寡核苷酸一个区域的连接器-杂交区域，其中连接器-杂交区域远离于目标分析物结合基，从而捕捉样品中的目标分析物。(iii)杂交一个连接器寡核苷酸到第一探针和第二探针的连接器-杂交区域上。(iv)连接第一探针的连接器-杂交区域到第二探针的连接器-杂交区域上，从而连接第一探针及第二探针的寡核苷酸尾巴。(ν)在第一个PCR启动子区域之间扩增连接的寡核苷酸尾巴区域。(vi)用一个基质固定的寡核苷酸杂交扩增产物，其中基质固定的寡核苷酸包含一个互补于条形码区域的第一区域，其中条形码区域唯一与第一探针的目标分析物结合基有关；和一个互补于条形码区域的第二区域，其中条形码区域唯一与第二探针的目标分析物结合基有关。(vii) 将步骤(V)产物与能特异切割单链DNA分子或区域的核酸酶连接，其中单链DNA有非碱基配对的3'或一个5'端。(viii)杂交一个信号寡核苷酸到步骤(Vi)产物上，其中信号寡核苷酸包含一个互补于第一探针及第二探针连接器-杂交区域，或者互补于第一探针连接器-杂交区域及第二探针连接器-杂交区域结合体的核苷酸序列，以及进一步包含一个标签。(ix)检测标签，从而检测样品中分析物的存在。在本申请的这方面的实施方式中，目标分析物可以从在其中的肽段，多肽，蛋白质或被修饰物的group consisting中筛选出来。在本专利技术的这方面的实施方式中，每个第一探针的结合基也许是从抗体，抗体片段，适体，肽段，多肽，生物受体，及可结合生物分子的配体中筛选出来的。在本专利技术的这方面的实施方式中，第二探针的结合基也许是从抗体，抗体片段，适体，肽段，多肽，生物受体，及可结合生物分子的配体中筛选出来的。在本专利技术的这方面的实施方式中，样品也许与一个标签结合，从而连接标签于目标分析物上，其中第一探针的结合基特异结合于目标分析物一个位点上，及第二探针的结合基特异结合于标签上。在本专利技术的这方面的实施方式中，标签也许是从染料，荧光染料及地高辛中筛选出来的。在本专利技术的这方面的实施方式中，第二探针的结合基能特异结合于一个多肽的修饰位点上。在本专利技术的这方面的实施方式中，一个多肽的修饰位点可以从包含一个磷酸化位点，一个糖基化位点，及一个多肽氨基酸序列的突变位点的组中筛选。在本专利技术的这方面的实施方式中，目标分析物可以是至少两个多肽的复合物，其中第一探针的结合基特异结合到第一个多肽的一个区域上，第二探针的结合基特异结合到第二个多肽的一个区域上，及在步骤(iii)中当第一个多肽与第二个多肽络合在一起时， 杂交一个连接器寡核苷酸到第一探针及第二探针的连接器-杂交区域上。在本专利技术的这方面的实施方式中，可特异地切割单链DNA分子或区域的核酸酶可从Rec J，核酸外切酶II，小腿脾磷酸二酯酶，核酸外切酶I (磷酸)，蛇毒磷酸和核酸外切酶 VII筛选出来。本专利技术的另一个方面提供了检测目标分析物的系统，包括第一探针及第二探针， 其中第一探针及第二探针各自独立地包含一个能特异结合目标分析物或者标签的结合基，及一个寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一个接近目标分析物结合基的PCR启动子区域，一个唯一目标分析物结合基有关的条形码区域，一个远离于目标分析物结合基的连接器-杂交区域；一个微阵列，其中这个阵列包含至少一个互补于第一探针及第二探针条形码的寡核苷酸。在本专利技术的这方面的实施方式中，第一探针的结合基可连接到寡核苷酸尾巴的5’ 端上，及第二探针的结合基连接到寡核苷酸尾巴的3’端上。在本专利技术的这方面的实施方式中，这个体系也许进一步包含一个互补于第一探针 PCR启动子区域的寡核苷酸及一个互补于第二探针PCR启动子区域的寡核苷酸。但是，本专利技术的另一个方面提供了探针，这些探针包含一个可特异结合目标分析物或其上的标签的结合基，及一个寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一个接近目标分析物结合基的PCR启动子区域，一个唯一与目标分析物结合基有关的条形码区域，一个连接器-杂交区域，其中连接器-杂交区域远离于目标分析物结合基，并且其中所述探针被配置为用在根据本专利技术的方法和系统中。附图说明根据以下描述的其多个实施例的详细说明的观点，并当结合附图时，将会更容易理解本申请进一步的方面。图1概要地说明本专利技术的芯片法邻位连接检测方法。图2简要说明阵列结合的单链核酸环的检测。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄若磐，
申请(专利权)人：广州瑞博奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：