本发明专利技术涉及具有非糖基化抗体Fc结构域的多肽的方法和组合物。在某些实施方案中，与天然Fc结构域相比，具有非糖基化Fc结构域的多肽包含一个或更多个替换。此外，一些实施方案涉及结合一些Fc受体但不结合其它受体的Fc结构域。例如，提供具有非糖基化Fc结构域的多肽，所述非糖基化Fc结构域以糖基化Fc结构域结合水平2倍之内的水平选择性结合FcγRI，但是对其它Fc受体的结合显著降低。此外，本发明专利技术提供使用具有修饰的非糖基化Fc结构域和第二非Fc结合结构域的多肽促进抗体依赖性细胞介导毒性(ADCC)的方法和组合物，所述的第二非Fc结合结构域可以是抗体的抗原结合区或者非抗原结合区。一些实施方案涉及具有此类多肽的抗体，其可以具有相同或者不同的非Fc结合结构域。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及蛋白质工程领域。更加具体而言，其涉及用于筛选在细菌中表达的组合抗体Fc文库的改良方法和组合物。
技术介绍
当前的重组治疗抗体销售超过100亿美元/年并且预计每年增长20. 9 %，到2010 年计划增长至250亿美元/年。单克隆抗体(mAbs)包括当前临床上的大多数重组蛋白，其中位于世界各地的公司资助超过150个正在研究的产品O^avlou和BelSey，2005)。至于治疗焦点，mAb市场主要集中于肿瘤学和关节炎、免疫和炎症性病症并且这些治疗领域内的产品将持续成为在整个预测阶段内的关键生长驱动力。总的来说，遗传工程化mAbs —般比小分子药物具有更高的FDA批准成功可能性。至少50个生物工程公司和所有的主要制药公司实施活性抗体开发项目。用于mABs分离和生产的最初方法由Milstein和Kohler于1975年首次报导 (Kohler and Milstein, 1975)，并且它包括小鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，得到小鼠杂交瘤。治疗性的鼠mAbs在二十世纪八十年代早期进入临床研究；然而，但是缺乏有效性和因为患者产生人抗小鼠抗体(HAMA)而快速清除的问题变得明显。这些问题以及与技术相关的时间和成本消耗变成了发展mAb生产技术的驱动力。聚合酶链式反应(PCR)促进了直接从免疫动物淋巴细胞克隆单克隆抗体基因和片段抗体组合文库在细菌中的表达 (Orlandi等，1989)。后来的文库完全通过体外克隆技术使用具有重排互补决定区3 (⑶R3) 的天然基因产生(Griffiths和Duncan，1998 ；Hoogenboom等，1998)。结果，具有目的特异性的抗体片段的分离不再依赖于相应抗原的免疫原性。此外，合成的组合文库中的抗原特异性范围比从免疫小鼠产生的一组杂交瘤的抗原特异性范围大。这些优点促进了开发针对许多种独特抗原，包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter，199 、分子复合体 (Chames等，2000)、不稳定的化合物(Kjaer等，1998)和细胞表面蛋白质(Desai等，1998) 的抗体片段。在微生物细胞中，通过流式细胞术开展展示筛选。具体而言，锚定周质表达 (Anchored周质ic Expression, APEx)基于将抗体片段锚定在大肠杆菌内膜的周质面，然后破坏外膜，与荧光标记的靶孵育并分选原生质球(美国专利7，094，571)。APEx用于抗体片段的亲和性成熟(Harvey等，2004 ;HarVey等，2006)。在一个研究中，在仅两轮的筛选后得到了超过200倍的亲和性改善。抗体治疗潜能背后的一个重要机制是抗体募集免疫细胞至靶抗原(或细胞)的能力。因此，抗体的Fc区对于募集免疫细胞和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)是至关重要的。具体而言，由抗体引起的ADCC反应的性质依赖于Fc区与位于许多细胞类型表面上的受体 (FcR)之间的相互作用。人包括5种不同种类的Fc受体。在另外的单元型中，属于特定种类的不同FcR的遗传变体是已知的。抗体与FcR的结合决定着募集其它免疫细胞和所募集细胞类型的能力。因此，工程改造可募集仅某些种类细胞的抗体的能力对于治疗是极其重要的。然而，据专利技术人所知，先前已经使用哺乳动物表达的IgG分子开展了改造Fc结构域的尝试。哺乳动物抗体是糖基化的。碳水化合物链连接至Fc区并且改变蛋白质的构象并且使得抗体能够结合至FcR。与此相比，由细菌产生的非糖基化的抗体不能够结合至FcR 并且因此不能够引起ADCC。希望的是，改造能够引起ADCC的非糖基化抗体并且，因此从源于细菌表达的低生产成本受益。第二并且最重要的是，具有工程改造Fc区的哺乳动物抗体表现出对特定的目的 FcR的结合增加，而且它们仍能够以正常亲和性结合其它FcR。因此，虽然此类抗体对于由免疫系统天然产生的分子具有更大的选择性，但是它们仍然可以介导不希望的免疫反应。虽然如此，目前可以利用的所有高通量抗体抗体筛选技术均依赖于抗体片段的微生物表达。已经描述了在文库构建和筛选中使用抗体片段而不是完整或者全长IgG相对于在微生物中表达长得多的IgG具有局限性。之前从来没有使用微生物如细菌或酵母表达或者筛选IgG文库。结果，对结合蛋白质的抗原的分离唯一使用更小的且容易产生的抗体片段开展。一旦分离后，然后此类抗体片段必须融合至表达全长免疫球蛋白的载体，反过来载体优先在哺乳动物细胞诸如CHO细胞中表达。大肠杆菌的的细胞质少，这不适合具有二硫键的蛋白质的折叠，具有二硫键的蛋白质以未折叠的或者不正确折叠的状态积累(Baneyx和Mujacic，2004)。与细胞质相比， 大肠杆菌的周质维持在氧化状态，这使得可以形成蛋白质二硫键。值得注意的是，已经成功地采用周质表达用于表达抗体片段，诸如Fv、ScFV、Fab或者F(ab' ) 2 (Kipriyanov和 Little，1999)。这些片段可以相对快速地大量产生，并且保留了抗原结合活性。然而，由于抗体片段缺乏Fc结构域，它们不能够结合Fcfoi受体并被快速清除；因此，它们仅偶尔适宜用作治疗蛋白质(Knight等，19%)。直到最近，全长抗体仅可以在大肠杆菌中表达成为不溶解的聚集物，然后体外重折叠(Boss等，1984 ;Cabilly等，1984)。显然，这种方法不适合抗体文库的高通量筛选，因为使用当前的技术不能够将数百万或者数千万的抗体逐一重折叠。进一步的问题是，由于大肠杆菌表达的抗体没有被糖基化，所以它们不能够结合补体因子Iq(Clq)或者Fc和许多其它Fc受体。然而，非糖基化的Fc结构域可以有效地结合新生儿Fc受体(Fcfoi)。因此，细菌表达的非糖基化抗体的确表现出与人细胞中产生的完全糖基化的IgG相似的血清持久性和药代动力学。虽然如此，由于非糖基化的抗体不能够引起补体活化并且不能够介导免疫细胞诸如巨噬细胞的募集，因此它们先前不能有效地用于许多治疗应用。此外，一些研究已经报导，Fc结构域与一些Fc受体的结合可以具有激活效应，而其它一些则具有抑制效应(Boruchov等.2005 ;Kalergis等，2002)。不同的Fc γ R效应器功能包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、吞噬作用和成熟作用。经工程改造具有选择性效应器功能的Fc结构域可以提供生理益处。
技术实现思路
本公开提供涉及结合Fc受体的非糖基化抗体Fc结构域的化合物和方法。在一些实施方案中，涉及包含具有来自抗体的非糖基化Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽的组合物。在另外的实施方案中，非糖基化Fc结构域是野生型Fc结构域的变体，以致于变异使得Fc结构域可以特异性结合至一种或者更多种Fc受体。在一些实施方案中，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽能够仅结合具有糖基化形式野生型Fc结构域 (“糖基化野生型Fc结构域”)可以结合的Fc受体的亚组。在特定的实施方案中，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽可特异性地结合Fc y RI ；在一些情况中，其亲和性或者结合能力在具有糖基化野生型Fc结构域多肽的2倍之内。在其它的实施方案中，另外地或者备选地，具有非糖基化Fc结构域变体的多肽与具有糖基化野生型Fc结构域的多肽相比具有显著降低的亲和性或者结合能力(50本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·乔吉欧，S·雷迪，S·T·郑，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：
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