本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体生产该基因的表达产物及其应用。即以金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌;大肠杆菌的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a（+）表达载体中，再转入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经IPTG诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶(NiRL)蛋白表达，从而获得植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因， 含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体生产该基因的表达产物及其应用。
技术介绍
亚硝酸盐还原酶是一类催化亚硝酸盐还原的酶。亚硝酸盐广泛存在于腌制或新鲜食物以饲料中。食品中亚硝酸盐的过量，会使血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，降低血液的载氧能力，造成高铁血红蛋白血症，对人体造成严重危害。亚硝酸盐还可在人体内与仲胺、 叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，从而诱发消化系统癌变。鉴于食品中超标亚硝酸盐污染可引起食品安全问题，人们正在努力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法，生物酶法消除食品亚硝酸盐是一条可行的途径。迄今，有不少报道认为植物乳酸菌具有降解亚硝酸盐的能力，并推测植物乳酸菌降解亚硝酸盐与所含的亚硝酸盐还原酶有关。然而，目前植物乳酸菌亚硝酸盐还原酶的基因及其基因编码的酶蛋白序列还未见研究报道。参考文献王琦，李悦鹏，娄峰阁.亚硝酸盐的危害及其替代物的研究进展.中国饮食卫生与健康，2005，2 (9) :36-37孙菲菲，蒋芳玲，侯喜林，李英等.白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及表达分析.园艺学报,2009，36 (10) 1511-1518Eugene J. Mitacek, Klaus D. Brunnemann, Maitree Suttaj it, Lee S. Caplan. Geographic Distribution of Liver and Stomach Cancers in Thailand in Relation to Estimated Dietary Intake of Nitrate, Nitrite, and Nitrosodimethylamine. Nutrition and Cancer, 60:2，196-203龚钢明，管世敏，邵海，吕玉涛.降解亚硝酸盐乳酸菌的分离鉴定.食品工业， 2009(5) :12-13G. Wolf, W. P. Hammes. Effect of hematin on the activities of nitrite reductase and catalase in lactobacilli. Arch Microbiol (1988) 149: 220 -224Krishna P. Rai, Chunhui Zhang, Wen Shui Xia. Effects of pure starter cultures on physico-chemical and sensory quality of dry fermented Chinese-style sausage, Food Sci Technol, 2010, 47(2) :188 - 194陈燕红，程萍，喻国辉，潘丽晶.沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris 2-8的亚硝酸盐还原酶基因克隆和序列分析.微生物学通报，2011，38(5): 647 653Braker G, Fesefeldt A, Witzel KP. Development of PCR primer systems foramplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples. Applied and Environmental Microbiology, 1998，64(10) : 3769 3775. Lima I, Moreira S M, Osten J R V, et al. Biochemical responses of the marine mussel Myfilus gal loprovincialis to petrochemical environmental contamination along the North-western coast of Portugal . Chemosphere, 2006， 66 (7) :1230-1242. Danes V, Alhama J, Navas JI, et al. Ecotoxicological effects of metal pollution in two mollusc species from the Spanish South Atlantic littoral . Environ Poll, 2006，139 :214-223. Antonio T, Carlos M. Environmental impacts of intensive aquaculture culture in marine waters. Water Research, 2000 , 34(1):334-342。
技术实现思路
本专利技术的目的之一为了解决上述的问题而提供一种人工合成的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因；本专利技术的目的之二提供了一种由上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因编码的蛋白质。本专利技术的目的之三是提供含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因转化而成的质粒。本专利技术的目的之四在于提供了一种含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因转化的质粒的重组大肠杆菌。本专利技术的技术原理以金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌；大肠杆菌等的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a ( + )表达载体中，再转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，经IPTG诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶(NiRL)蛋白表达， 获得植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白。本专利技术的技术方案一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO: 1的多核苷酸； 含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因的重组质粒。上述的重组质粒优选为pET_32a ( + ) - NiRL质粒，其中所用的载体pET_32a ( + ) 还可以采用常用的其他PET、pKK223-3或ρΗΤ载体替代。当选用PET载体时，可以选用大肠杆菌或枯草杆菌表达，当选用ΡΚΚ223-3载体时要用大肠杆菌JM105表达，而当选用ρΗΤ载体时要用枯草杆菌表达系统。所述的重组质粒转化而成的重组微生物，所述的重组微生物为重组大肠杆菌或重组枯草杆菌，且所述的重组大肠杆菌优选为Ε. coliBL21 (DE3)或JM105。利用上述的重组大肠杆菌或重组枯草杆菌生产的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶，该还原酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。本专利技术的技术效果本专利技术通过以金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌；大肠杆菌等的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a ( + )表达载体中，再转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，经IPTG诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龚钢明，何婷婷，高然，
申请(专利权)人：上海应用技术学院，
类型：发明
国别省市：
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