本发明专利技术公开了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用。该方法是将去除跨膜区和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该表达方法有助于提高目的蛋白的表达量，简化了下游的纯化工作，可较容易地实现蛋白的规模化生产，且批间质量稳定。以本发明专利技术重组蛋白作为捕获抗原可用于血浆样本中抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的间接ELISA检测，可提高临床诊断VZV感染的准确性，并用于其它需要VZV特异性免疫球蛋白进行高通量检测的领域。
【技术实现步骤摘要】
一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用
本专利技术属于蛋白的重组表达方法及其应用，特别是涉及一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其在抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的ELISA 检测中的应用。
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)属于疱疹病毒科，α病毒属，人是其唯一宿主，因此又称人疱疹病毒3型，感染后可引起两种不同的临床病理症状。 VZV初次感染多发于青少年时期，表现为全身性的水疱疮(水痘)，此后，病毒潜伏在感觉神经节，当携带者由于免疫力低下等原因，病毒可再次激活而引发带状疱疹(病毒通过神经传播，到达表皮细胞，沿肋间神经区域形成水疱疹症状)。VZV的初次和再次感染均会引起中枢神经系统的病理症状，多表现为脑膜炎、脑炎、面瘫等，但往往不伴随疱疹体征，因而不利于该病毒感染的临床诊断和早期抗病毒治疗。目前，临床多采用提取病人脑脊髓液中的核酸，进行探针法定量PCR确定患者是否为 VZV 感染。但 Steiner 等(Steiner I, Budka H, Chaudhuri A, et al. Viral meningoencephalitis -.a review of diagnostic methods and guidelines for management. Eur J Neurol. 2010，17 :e957_e999.)证明 PCR 鉴定受限于采样的窗口期，因此，虽然该方法具有很好的灵敏性，但易造成假阴性，并且VZV基因组与其它人α -疱疹病毒基因组，特别是单纯疱疹病毒，具有很高的同源性，因而不排除有假阳性的检测结果。 基于上述原因，研究者将VZV感染的诊断转向血清学的检测方法，Breuer等(Breuer J， Schmid DS, Gershon AA. Use and limitations of varicella-zoster virus-specific serological testing to evaluate breakthrough disease in vaccines and to screen for susceptibility to varicella. J Infect Dis. 2008，197 (S2) :S147_S151.)使用 VZV 感染的细胞膜蛋白裂解物作为捕获抗原，建立间接ELISA方法检测血浆中VZV特异性免疫球蛋白的含量，虽然与金标准膜抗原免疫荧光法(fluorescent antibody to membrane antigen, FAMA)相比具有很好的一致性，但仍存在与其它人疱疹病毒特免交叉反应的可能性。因此，建立可靠的血清学检测方法，提高检测体系的特异性，避免交叉反应，对于临床 VZV感染的诊断及高通量抗VZV特异性免疫球蛋白的筛选具有重要意义。由于间接ELISA反应体系的灵敏性与捕获蛋白的包被浓度有关，而特异性与包被蛋白的抗原决定簇有关，因此，选择病毒特异性的抗原决定簇是提高抗VZV特异性免疫球蛋白检测特异性的关键。已知VZV为双链DNA病毒，包括125000个碱基对，全部碱基序列已由Davison 等人确定，并公开发表(Davison AJ, Scott JE. The complete DNA sequence of Varicella-Zoster Virus. J gen Virol. 1986，67 :1759-1816.)。该基因组中至少存在着 72个0RF，编码33种VZV特有蛋白和13种糖蛋白，其中已发现gE (gp I )、gB(gpII)、gH(gp III)、gl (gp IV )、gC(gp V )和gL(gp VI)等6种糖蛋白共同存在于病毒囊膜表面和感染细胞的膜表面。糖蛋白E对于病毒复制是必不可少的，同时也是感染细胞膜表面以及成熟病毒囊膜表面存在的最丰富的糖蛋白，高度保守，其作为候选亚单位疫苗的研究表现出良好的抗原特异性和抗体结合性。由于野生型VZV gpE的蛋白分子包括有四个区域，即信号肽(aal-24)、胞外区(aa25_539)、跨膜区和胞内区(aaM0_624)，而E蛋白的3个抗原决定族均分布在胞夕卜区(Grose C. Glycoproteins encoded by varicella-zoster virus :biosynthesis, phosphorylation, and intracellular trafficking. Annu Rev Microbil. 1990,44 :59-80.)。由于采用单抗亲和层析法，从VZV感染细胞的裂解物中提取足量的gpE需要大量的人力、物力资源并且代价较为昂贵，如果能利用基因重组技术对相应的抗原进行重组表达则可避免上述方法的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法。本专利技术所提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法，是将去除跨膜区(疏水区)和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白EfelycoproteinE，gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。所述His标签位于水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的羧基(C)端。所述添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因可通过位点特异性整合系统Flp/FRT导入宿主细胞，具体方法可为将添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因插入载体pcDNA5/FRT/TO的多克隆位点中，再将该携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的中间载体与携带FLP酶基因的pOG44质粒共转染宿主细胞FLP-In-CHO，经筛选得到整合有添加His标签的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的宿主细胞。在上述通过位点特异性整合系统Flp/FRT导入宿主细胞的中间载体中，所述添加 His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的上游为Pa 启动子，下游为FRT位点和筛选标记，所述筛选标记可为潮霉素B抗性基因、新霉素抗性基因或杀稻瘟素抗性基因等任一可用的筛选标记基因。其中，以pcDNA5/FRT/TO为出发载体构建的携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的重组载体为pcDNA5/FRT/T0-gpE-His。所述筛选条件可为用浓度为200-400 μ g/mL(优选为300 μ g/mL)的潮霉素筛选 1-3周(优选为2周)。用上述重组表达方法得到的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种抗水痘-带状疱疹病毒免疫球蛋白的ELISA检测试剂盒，其中包括了上述重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。具体还可包括包被缓冲液，使蛋白浓度 1 μ g/mL ；50 X 漂洗缓冲液 20ml ；anti-VZV IgG 国际标准品 NIBSC (50IU/ml) 200 μ 1 ； HRP标记羊抗人IgG (H+L)抗体20 μ 1 ；可溶性TMB显色底物20ml ；反应终止液20ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章金刚，王卓，唐倩，吕茂民，冯晶晶，马玉媛，王建国，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：
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