用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA表达盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA，并且更具体地，涉及多顺反子shRNA表达盒，包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体，用所述多顺反子shRNA表达载体转导的细胞，所述表达载体和转运体的复合物，抑制各种靶基因的方法，以及包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA表达盒专利技术背景 1.专利
本专利技术涉及用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA，并且更具体地，涉及多顺反子shRNA表达盒，包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体，用所述多顺反子shRNA表达载体转导的细胞，所述表达载体和转运体的复合物，抑制各种靶基因的方法，以及包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。2.相关领域描述RNA干扰(在下文中，被称为RNAi)是指通过细胞内引入双链RNA(dsRNA)选择性诱导靶mRNA降解以及靶基因沉默的现象，所述双链RNA(dsRNA)由与靶基因的mRNA同源的正义RNA和具有与所述正义RNA互补的序列的反义RNA组成。通过RNAi的选择性靶基因沉默代替通过同源重组的常规低效的基因阻断作为简单的基因敲低(knock-down)或基因治疗，越来越受关注和广泛利用。化学合成的小干扰RNA(在下文中，被称为“siRNA”)和启动子-依赖型表达的小发夹RNA(在下文中，被称为“shRNA”)在体外和体内显示有效力的基因沉默活性。然而，与化学合成的siRNA相比，启动子-依赖型shRNA提供几个优势特点， 包括在细胞和整个有机体内稳定表达，组成型或诱导型表达，以及细胞类型特异性表达。可以将shRNA分成两种不同的类型第一代和第二代shRNA (附图说明图1)。第一代shRNA简单地模拟化学合成的siRNA，而第二代shRNA源自在各种有机体内表达的天然microRNA，并且显示更强的功能性。第二代shRNA的结构特征(图1)还允许更灵活地选择启动子和靶shRNA序列。在siRNA的情况下，作用于不同位点的混合siRNA比作用于单一位点的单个siRNA 被更频繁地用于沉默单靶基因，因为作用于不同位点的混合siRNA显示更强的沉默活性， 并且各种siRNA可以通过化学合成容易地制备。还将作用于不同位点的混合siRNA用于沉默多个不同的基因，从而适当地沉默各种基因。相反地，启动子-依赖型shRNA主要用作单顺反子，致使仅沉默一个单靶基因。因此，为利用启动子-依赖型shRNA沉默多靶基因，递送对应于靶基因数量的多个shRNA表达构建体是必要的。因而，若利用仅仅一个单一 shRNA 表达构建体可以沉默多靶基因，该方法将显著最小化由使用多个表达构建体引起的忧虑， 包括难以表达等摩尔量的shRNA，相同的启动子重复序列之间重组频率高，以及shRNA表达构建体在治疗手段如基因治疗的开发中的质量控制。此外，该方法将允许简便且快速地分析多靶基因的功能。为了通过利用一个shRNA表达构建体沉默单或多靶基因的目的，本专利技术人注意到第二代shRNA，尤其是源自mir-30的shRNA，因为该shRNA已被更好地表征结构和核酸酶剪切位点。本专利技术人假设mir-30micrORNA的结构特征，重要的是与microRNA的先导序列相关的结构灵活性，可能允许形成表达含有多shRNA的多顺反子转录本的盒。本专利技术人做出努力以证明该假设，由此完成了本专利技术。专利技术简述本专利技术的目的是提供多顺反子shRNA表达盒，其包含启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个编码对靶基因特异的shRNA(小发夹RNA)的多聚核苷酸。本专利技术的另一个目的是提供包含所述表达盒的表达载体，用所述表达载体转导的细胞，以及所述载体和转运体的复合物。本专利技术的又一个目的是提供利用所述表达盒抑制各种目的靶基因的方法。本专利技术的还一个目的是提供包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。附图简要说明图1显示siRNA、第一代shRNA和第二代shRNA的结构比较，其中比较了化学合成的siRNA和两种不同的shRNA，并且核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列，并且在第二代shRNA中，圈出的是用于相应转录本正义链的第一个核苷酸，并且核酸酶剪切位点由Drosha和Dicer的直线标示。图2显示单独的shRNA表达构建体的功能测试，其中A.显示源自mir-30的模板shRNA序列，除核苷酸链外，该序列标示于框内，而颜色相反的框通常用作制备所有shRNA表达构建体的模板；B.显示设计用于沉默人XIAP、Akt和Bcl-2的shRNA序列，其中核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列；C.显示将与同源shRNA相应的插入DNA序列克隆至穿梭载体中用于生产腺病毒；D.显示制备腺病毒，其中通过Cre-Iox重组产生表达shRNA的腺病毒 ’及E.显示用于表达单顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或每一 Ad-shRNA感染HCT116细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且 β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。图3显示通过多顺反子shRNA表达载体沉默基因，其中Α.为用于含有多个shRNA的pAdlox(K)穿梭载体的示意图；B.显示制备表达多顺反子shRNA的腺病毒，其中通过Cre-Iox重组产生 Ad-multi_shRNA ；及C.显示用于表达多顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或Ad-multi_shRNA感染HCTl 16细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且 β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。图4显示用于由一个多顺反子转录本产生不同shRNA的过程的模型，其中转录和shRNA加工合并发生，以逐步的方式加工在一个单个转录本的每一 shRNA单位，并且一旦转录第一个shRNA，它形成独特的结构并由主要位于细胞核内的核酸酶Drosha剪切， Drosha-剪切的shRNA被输出至细胞溶质并由细胞溶质的核酸酶Dicer进一步加工，并且不断重复这一完整的循环以产生在多顺反子转录本中编码的所有shRNA。图5显示用于沉默一个单靶基因的多顺反子shRNA表达载体的组成，其中A.显示多顺反子shRNA表达载体中的shRNA各自靶向单靶基因的不同位点；以及B.显示多顺反子shRNA表达载体中的shRNA各自靶向单靶基因的不同位点(ABC 型)，或者单靶基因的相同位点(AAA、BBB, CCC型)。图6显示用于单靶基因的多顺反子shRNA的组成，所述单靶基因即通过多顺反子 mFas shRNA表达载体沉默的基因，其中A.显示设计用于沉默mFas的每一 shRNA序列，核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列；B.显示制备表达多顺反子mFas shRNA的腺病毒，其中通过Cre-Iox重组产生 Ad_multi_shRNA(0、M、Q、R 型)；C.显示用于表达多顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或 Ad-multi_shRNA(0 :mFas#l-#2-#3)或 Ad_multi_shRNA (Μ :mFas#l-#l_#l)或 Ad-multi_shRNA(Q :mFas#2-#2-#2)或 Ad-multi_shRNA (R :mFas#3-#3-#3)感染 H印al_6 细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。D.显示比较表达单顺反子shRNA与多顺反子shRNA的腺病毒之间的沉默活性，其中用 Ac本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛大寓，
申请(专利权)人：薛大寓，
类型：发明
国别省市：