胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种治疗人I型和II型糖尿病的融合蛋白的氨基酸序列，以及生产方法和应用，本发明专利技术涉及一种能避免胰岛素抵抗的非胰岛素糖尿病疗法。本发明专利技术涉及的融合蛋白由胰岛素模拟肽与IgG-Fc或IgG-Fc突变体通过连接肽相互融合形成，在保留胰岛素模拟肽降低血糖活性的同时，能明显的提高胰岛素模拟肽的体内半衰期。其中，IgG-Fc的突变体能进一步增加融合蛋白体内的半衰期。

【技术实现步骤摘要】
胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用专利
本专利技术涉及人糖尿病的预防和治疗药物。具体的，本专利技术提供一种用于检测和治疗人I型和II型糖尿病的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有胰岛素模拟肽(IMP)和人IgG-Fc(铰链区-CH2-CH3)蛋白和/或IgG-Fc突变体(T250Q/M428L；QL和T307Q/N434A；QA)，能有效降低糖尿病患者的血糖水平，增加胰岛素模拟肽体内的半衰期，尤其是IgG-Fc(QL/QA)的突变体，能进一步增加胰岛素模拟肽的体内代谢半衰期，减少药物的注射频次。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病是造成人类死亡的主要病因之一，全球大约有2亿患者。糖尿病在中国的发病率达到2％，据统计，中国目前已有3980万糖尿病病人，位居全球第二。预计到2025年，中国糖尿病患者将达到5900万人。中国目前每年约有100多万新增病例。其中I型糖尿病患者占10％，II型糖尿病患者占90％。据业内专家估计，目前国内糖尿病药物的市场容量约70亿元人民币，根据卫生部公布的数据分析显示，未来几年中国糖尿病类药物的销售量将会超过100亿元人民币。糖尿病的主要分为I型糖尿病和II型糖尿病。其中，I型糖尿病是一种常在小儿或青少年时形成的复杂T细胞依赖自身免疫性疾病(Juneia和Palmer，Autoimmunity.1999；29(1)：65-83)。是由胰岛β细胞的免疫性破坏造成伴随相应的胰岛素缺乏和对外源性胰岛素的依赖。单核细胞对胰腺内分泌细胞及组织的病灶性侵润以及功能性β细胞的数量和质量的显著减少是诊断该疾病的组织病理学的特点，但是这些损伤的程度个体间差异显著。自身免疫性破坏使得T细胞侵润到胰岛(isletsofLangerhans)，结果出现β细胞的凋亡(Lee等人，MolGenetMetab.2004；83(1-2)：82-92；Mandrup-poulsen，BiochemPharmacol.2003；66(8)：1433-1440；Scsti，AnnMed.2002；34(6)444-450；Mathis等人，Nature.2001；414(6865)792-798)。为研究糖尿病潜在的分子机制，已经建立了多种动物模型。例如，用链脲霉素(streptozotocin)(STZ)诱导的胰岛素缺乏性的大鼠或小鼠模拟在糖尿病患者体内可见的T-细胞介导的炎症和胰岛细胞的破坏。此外，非肥胖糖尿病(NOD)的小鼠是另一个研究自身免疫性疾病的模型，其中胰岛-抗原活性T细胞浸润胰岛并杀死胰岛β-细胞，并且/或者引发炎症过程导致胰岛β细胞的死亡(AandersonandBluestone，AnnuRevImmunol.2005；23：447-485)。胰岛素疗法是干预I型糖尿病的主要手段。通过激活胰岛素受体，调节体内血糖水平。胰岛素的受体是一个四聚体，由两个α亚基和两个β亚基通过二硫键连接。两个α亚基位于细胞质膜的外侧，其上有胰岛素的结合位点；两个β亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。当胰岛素与受体的α亚基结合并改变了β亚基的构型后，酪氨酸蛋白激酶才被激活，激活后可催化两个反应：1、使四聚体复合物中β亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化，这种过程称为自磷酸化(autophosphorylation)；2、将胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRSs)上具有重要作用的十几个酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的IRSs能够结合并激活下游效应物来调节血糖。II型糖尿病是一种通常在成人期诊断的多基因功能失常，其以引起高血糖症的三个主要异常为特点：1.外周胰岛素抵抗、2.肝糖原的过量生成、3.胰腺β-细胞功能障碍。胰岛素抵抗是指外周组织主要是骨骼肌细胞对胰岛素的反应降低，导致葡萄糖运输到这些组织的障碍(Kahn和Goldfine，JdiabetesComplications.1993；7(2)：92-105；Weyer等人，JclinInvest.1999；104(6)：787-794)。胰岛素抵抗同样可以发生在肝脏，致使在肝脏中胰岛素不能有效地抑制肝脏葡萄糖的生成(Kahn和Goldfine，JdiabetesCompliations.1993；7(2)：92-105；Lam等人，Am.JphysiolEndocrinolMetab.2002；283(4)E682-E691)。胰岛素抵抗的结果是机体对胰岛素的需求增加。在胰岛素抵抗的早期阶段，通过增加胰岛素分泌引起胰腺内β细胞质量增加的代偿机制。这些患者的血糖水平仍然可维持在正常范围内(BonnerWeir，TrendsEndocrinolMetab.2000；11(9)：375-378；Bonner-Weir，Endocrinology.2000；141(6)：1926-1929)。许多研究表明，如果能维持胰腺β-细胞的代偿功能，胰岛素抵抗本身还不足以激发糖尿病的发作(Weyer等人，Diabetes.1999，48(11)：2197-2203)。但胰岛素抵抗长时间不予纠正并变得严重，对胰岛素的过度需求导致β-细胞衰竭，胰岛素分泌减少，并出现空腹高血糖症状和明显的糖尿病(DeFronzo，Diabetes.1988；37(6)：667-687；Kahn等人，JNutr.2001；131(2)：354S；Weyer等人，JClinInvest.1999；104(6)：787-794)。II型糖尿病的常规治疗包括节食和锻炼以及使用磺基脲(sulphonylureas)、甲福明二甲双胍和胰岛素进行药物性干预。但在大多数患者中这些治疗通常都无法阻止血糖控制的长期下降和β细胞的功能紊乱(Matthews等人，DiabetMed.1998；15(4)：297-303；Turner等人，JAMA.1999；281(21)：2005-2012)临床上针对II型糖尿病所采用的阶梯式的治疗方法最终也无法维持血糖平衡，对于大多数患者，从节食和锻炼到单因素药物治疗、从联合治疗最终到胰岛素治疗成为不可避免的过程(Turner等人，JAMA.1999；281(21)：2005-2012；Gerich，EurJClinInvest.2002；32Suppl3：46-53)。胰岛素受体是由两个135-kDa的胞外亚基和两个95-kDa的跨膜跨越亚基组成的二硫键相连的二聚体蛋白，含有由上游结合配体激活的细胞内酪氨酸激酶结构域(Ebina，Y.等人，Cell.1985；40，747-758和Ullrich，A.等人，Nature.1985；313，756-761)。当胰岛素结合到受体后，激活一系列的代谢和有丝分裂反应，这些反应是由包括IRS1、2和Shc在内的几个胞外蛋白基质上的酪氨酸激酶发生磷酸化而产生(White，M.F.，Diabetologia.1997.40，Suppl.2，S2-S17)。IRS1和IRS2是主要的胰岛素受体底物，导致糖代谢，并在不同的器官有独特的和重叠的角色。此外，IRS1和IRS2的修改与糖尿病的发生有非常直接的关系。(Ya本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，由胰岛素模拟肽通过连接肽(Linker)与IgG-Fc或IgG-Fc突变体形成，其通式为IMP(Insulinmimeticpeptides)-Linker-IgG-Fc或者IgG-Fc-Linker-IMP(Insulinmimeticpeptides)；所述IMP多肽的序列为SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFERQL或SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFERQA；所述IgGFc(铰链区-CH2-CH3)序列为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc及其突变或缺失体，上述序列选自SEQIDNO：9；SEQIDNO：10；SEQIDNO：11或SEQIDNO：12，其中IgG-Fc序列参照EU(Kabat)指数进行编号，上述IgG-Fc突变体选自序列SEQIDNO：13；SEQIDNO：14；SEQIDNO：15；SEQIDNO：16，上述突变位点可以是单位点突变或多位点突变组合，其中：Xaa1＝Gln或ThrXaa2＝Gln或ThrXaa3＝Leu，Met或HisXaa4＝Ala或Asn；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，
申请(专利权)人：张海涛，
类型：发明
国别省市：